2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development a novel method to produce a single protein in yeast
| Project/Area Number |
16K14906
|
|---|
| Research Institution | Osaka City University |
|---|
Principal Investigator |
山口 良弘 大阪市立大学, 複合先端研究機構, 特任准教授(テニュアトラック) (00737009)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | SPP system / MqsR / MazF / Yeast |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、真核生物である酵母を用いた目的タンパク質のみの発現を可能にする yeast SPP system 確立のために (1)大腸菌の RNA 配列特異的分解酵素遺伝子を酵母で厳密に発現制御可能な発現ベクター (2)低温で目的タンパク質を高発現できる目的タンパク質発現ベクター、の2つの発現ベクターを構築し、 yeast SPP のプロトタイプを確立することを目的としている。
昨年度、ACA 配列特異的に RNA を分解する MazF をガラクトース誘導性プロモーターで誘導できるプラスミドを用いて酵母を形質転換した。その結果、MazF による酵母の生育阻害を確認できた。しかし、 MazF による生育阻害活性は代謝が active だが生育は完全に停止している SPP 状態の維持には不十分だった。そこで本年度の実験は、MqsR に着目した。MqsR は GCU、GCC および GCA 配列を特異的に切断する RNA 分解酵素である。そこで、まず初めに MqsR で SPP 状態を維持できるか大腸菌を用いて確認した。その結果、MazF と同様に MqsR を用いても大腸菌 SPP system は機能することが示された。MqsR を用いた SPP system に問題ないことが確認できたため、昨年度と同様に MqsR の発現ベクターおよびプロモーターおよび転写終結領域から MqsR 切断配列を除いたプラスミドを構築し実験に用いた。酵母での SPP system に最適な温度および誘導時期を検討し、最適と思われる条件を決定した。本条件を用いて目的タンパク質のみの発現を酵母を用いて試みた。その結果、酵母でのバルスラベルに問題があることが判明した。そこで、さらにパルスラベルの条件などを検討した。しかし、これまで最適な条件は決定できていない。
|
