2016 Fiscal Year Research-status Report
植物ウイルスの複製機構を利用した新規酵母タンパク質発現系の開発に関する研究
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16K14909
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
西宮 佳志 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (00357716)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 発現系 / 酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タバコモザイクウイルス（TMV）のRNA複製機構を利用した酵母用RNA複製ベクターを構築するために、約450塩基長に分割した14種類のDNAを化学合成した。これらを元にオーバーラップPCRにより2つのDNA断片を連結し、約850塩基長の7種類のDNA断片を構築した。直鎖化したベクターと7種類のDNA断片を同時に酵母Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae)へ導入し、相同組換えによる連結およびベクターへの組込みを試みた。形質転換したS. Cerevisiaeを選択培地に塗布し、得られたコロニーを用いてPCRを行い、インサートを確認した。目的の断片長が確認されたコロニーを培養し、ベクター（以後、基本ベクターとする）を抽出した。
外来タンパク質（蛍光タンパク質）発現ベクターを構築するため、上記で抽出した基本ベクターを鋳型に5’ 非翻訳領域（5’-UTR）、TMVのRNA複製に係る酵素群（メチルトランスフェラーゼ、ヘリカーゼ、RNA 依存性RNA 合成酵素）、サブゲノムプロモーター部分および3’-UTRをPCRで増幅した。これらのDNA断片と蛍光タンパク質の遺伝子、直鎖化したベクターでS. Cerevisiaeを形質転換し、DNA断片の連結およびベクターへの組込みを行った。
構築したこれらのベクターで大腸菌を形質転換し、ベクターの増幅・精製を行った。シーケンスにより、基本ベクターと外来タンパク質発現ベクターに正しい配列が導入されていることを確認した。
次に、酵母内でRNA複製に係る酵素群を発現させ、サブゲノムプロモーター下流の蛍光タンパク質RNAの複製と翻訳を促進させるために、三種類の酵母用のプロモーターをそれぞれTMV由来遺伝子の上流に組込んだ。現在、蛍光タンパク質（EGFPとDsRed） の蛍光強度を指標に発現効率を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、基本ベクターを制限酵素消化し蛍光タンパク質の遺伝子をライゲーションすることで外来タンパク質発現ベクターを構築する予定であった。しかし、酵母での基本ベクター構築は順調に進んだものの、大腸菌への導入、増幅・精製は予想以上に手間取った。酵母から回収できるベクター量は僅かであり、比較的長鎖（10 kb以上）のため大腸菌の形質転換効率も低い。また、形質転換に成功してもベクターが大腸菌で増幅され難く、遺伝子欠損が生じた。進捗の遅れを最小限にするために、外来タンパク質発現ベクターの構築も酵母の相同組換えを利用して基本ベクターと同時並行で進めた。さらに大腸菌株や培養条件の検討を行った。現在では目的のベクターを増幅・精製することが可能となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ベクターの調製が可能になったことから、RNAの転写量および外来タンパク質の発現量を評価するための信頼性の高いデータを取得する。RNAの転写量評価に関しては、研究計画段階でノーザンハイブリダイゼーションを予定していたが、定量逆転写PCR(qRT-PCR)を行うことにする。また、外来タンパク質発現量の評価（蛍光強度測定）については既に評価系を構築しており引き続きデータの蓄積をはかる。
サブゲノムプロモーター領域の最適化は、PCRにより構築するサブゲノムプロモーターライブラリーを発現ベクターに挿入し、タンパク質発現量を指標に改変型サブゲノムプロモーターを選択することで行う。また、平成29年度計画の「複数種タンパク質発現法の検討」と「RNA 複製機構の伝播性の評価」は計画書に沿って行う。
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| Causes of Carryover |
平成28年度の研究進捗が予定よりも遅れたため、使用予定であった試薬等の購入を見合わせたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度未使用分は、主にRNA転写量を評価するための試薬購入に使用する。平成29年度分は、培養関連試薬・消耗品やタンパク質発現量およびRNA転写量評価用試薬のほか成果発表に使用する。
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