2017 Fiscal Year Research-status Report
植物ウイルスの複製機構を利用した新規酵母タンパク質発現系の開発に関する研究
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16K14909
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
西宮 佳志 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (00357716)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 発現系 / 酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に構築したタバコモザイクウイルス（TMV）のRNA複製機構を利用した酵母用発現ベクター（酵母用プロモーター（5種）－5’非翻訳領域－TMVのRNA複製に係る酵素（メチルトランスフェラーゼ，ヘリカーゼ，RNA依存性RNA合成機能を有する融合酵素）－サブゲノムプロモーター領域－蛍光タンパク質（EGFPまたはDsRed）－3’非翻訳領域 を導入したもの）で出芽酵母Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) を形質転換し蛍光強度を測定した。しかし，使用する酵母用プロモーターの種類に関係なくどの形質転換体でも蛍光は検出できなかった。蛍光タンパク質の発現量が非常に低く蛍光を検出できていない可能性を考慮し，サブゲノムプロモーター下流に組込む外来タンパク質を蛍光タンパク質からヒスチジン合成酵素（栄養要求性選択マーカー）に変更したベクターを構築した。このベクターでヒスチジン要求性の S. Cerevisiae を形質転換し，ヒスチジンを欠損した合成培地に塗布した。形成されたコロニーは数個であった。これらについてコロニーPCRでベクターの状態を確認したところ，ベクターの存在が確認できないもしくは一部が欠損したベクターを有していることが分かった。このことから，ヒスチジン合成酵素が発現されていない，すなわちサブゲノムプロモーターの下流に組込まれた外来タンパク質は発現されていないことが示唆された。また，RNA複製に係る酵素に His6-tag を融合したベクターも構築した。このベクターで S. Cerevisiae を形質転換し，総タンパク質をポリアクリルアミドゲルで電気泳動後，PVDF膜に転写し抗ヒスチジンタグ抗体を用いて酵素の検出を試みたが酵素の発現を確認できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の設計に従ってベクターを構築したが，予想した通りには機能しなかった。その原因については確定できていないが，可能性として 1) RNA複製にかかわる酵素のコドンに複数含まれるレアコドンの影響，2) mRNA の poly(A) 除去によるmRNAの分解促進あるいは翻訳効率の著しい低下，3) 3’非翻訳領域に挿入した自己切断型リボザイムの不活性，が考えられる。これらへの対策を進めており，現在，メチルトランスフェラーゼ (MT) およびMTとヘリカーゼの中間領域にある22個のレアコドンを同義置換したベクターの構築が終了している。
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| Strategy for Future Research Activity |
構築したベクターが機能しない原因の特定を急ぐ。RNA複製にかかわる酵素（レアコドン置換済み）の遺伝子のみを酵母用の一般的な発現ベクターに導入し発現を確認する。発現が確認されれば，これまでに構築した外来タンパク質発現用ベクターを鋳型に T7 RNAポリメラーゼを用いて in vitro でpoly (A) tail を持たないRNA を合成する。これらをエレクトロポレーションで S. Cerevisiae に導入し，外来タンパク質の発現を評価する。また同時に，poly(A) tail のないmRNAに対する翻訳効率が高い S. Cerevisiae 変異株（ski2欠損株等）の取得も試みる。RNAの導入により外来タンパク質の発現が確認できる場合，目的とするmRNAが細胞質に輸送されないまたは細胞質内で安定的に存在できないことが示唆される。また，外来タンパク質の発現が確認できない場合は設計した遺伝子の構成に問題があると示唆される。本検証結果を基に対応策を講ずる。具体的には，mRNA の安定化のために S. Cerevisiae 変異株（ski2欠損株等）の利用やpoly(A) tail の切断調整（リボザイムの活性が二価イオンの濃度に依存することによる），遺伝子構成の再設計としてTMVゲノムRNAにより忠実な設計（RNA複製にかかわる酵素の遺伝子と次にコードされるタンパク質の遺伝子に重なりがある）を考えている。
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| Causes of Carryover |
（理由） 研究進捗が予定よりも遅れたため，使用予定であった試薬等の購入を見合わせたため。
（使用計画） 遺伝子工学試薬・消耗品，RNA合成試薬，RNA精製キットのほか，培養関連試薬・消耗品，タンパク質発現量およびRNA転写量評価用試薬に使用する。
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