2016 Fiscal Year Research-status Report
ミズクラゲ幼生の変態を制御するインドール酢酸生合成ネットワークの解明
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16K14916
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
国吉 久人 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (60335643)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ミズクラゲ / 幼生 / 変態 / インドール酢酸 / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミズクラゲ幼生体内に存在するIndole-3-acetic acid (IAA)関連物質を分析するため、抽出法を検討した。ポリプまたはストロビラを50匹以上集め、冷メタノール 2 mL中でホモジナイズした後、遠心分離をおこない、上清を回収した（メタノール画分）。さらに、残渣に冷2 %食塩水を加え、ホモジナイズした後、遠心分離をおこない、上清を回収した（食塩水画分）。各抽出画分について、生物検定法による変態調節活性の有無を調べた結果、ポリプのメタノール画分には変態開始阻害活性が、ストロビラの食塩水画分にはポリプ化活性が検出された。以上の結果から、この抽出条件では、IAA（変態開始阻害活性物質）はメタノール画分に、Tryptamine (TAM)（ポリプ化活性物質）は食塩水画分に回収されることが示唆された。
IAA生合成酵素群の候補遺伝子について再検討した。トランスクリプトーム解析により、ミズクラゲ幼生ではAromatic L-amino acid decarboxylase (AADC)、Monoamine oxidase (MAO)、Aldehyde dehydrogenase (ALDH)の３酵素によってIAAが生合成されることが予想された。さらに、local BLASTによって、それぞれの相同遺伝子を探索しなおした結果、AADCでは2個、MAOでは1個、ALDHでは4個の相同遺伝子が存在することが判明した。このうち、いくつかの遺伝子について部分配列しか得られていなかったため、inverse PCR法やRACE法による両末端の未知配列部分の増幅を試みた。これまでに、AADCの1つを除いた全ての遺伝子の全長塩基配列を明らかにしている。現在、培養細胞を用いた各酵素タンパクの発現のため、end-to-end PCRによる全長cDNAのクローニングを進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究実施計画で予定していたLC-MS/MSを用いたIAA関連物質(TAM, IAAなど)の分析系の確立については、現在までに良好な結果が得られていない。広島大学共通機器のACQUITY UPLC-TQD (Waters)を使用して、市販の合成標品を用いた条件検討をおこなったが、標品のシグナルを検出できなかった。したがって、【Exp.1】のIAAとその生合成中間体の分析については、ミズクラゲ幼生からの抽出法を確立したものの、各物質の分析には至っていない。
研究実施計画では、ミズクラゲのIAA生合成経路を構成すると考えられる３つの酵素について、培養細胞による発現系を用いて酵素タンパクを調製し、それぞれの活性を確認する予定であった。しかし、各酵素をコードする遺伝子について再検討をおこなったところ、AADCとALDHでは複数の相同遺伝子が存在すること、酵素遺伝子のいくつかは部分配列しか得られていないためにORFの一部のアミノ酸配列が不明であることの2つの問題に直面した。培養細胞による発現に進める前に、これら全ての酵素遺伝子の全長配列を得る必要があるため、現在は全長cDNAのクローニングを進めている段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
【Exp.1】については、LC-MS/MSを用いたIAA関連物質の分析系の確立を達成したい。ACQUITY UPLC-TQD (Waters)を用いた分析ではうまくいかなかったので、広島大学自然科学研究支援開発センターのLTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific)を利用する予定である。実験に当たっては、本機種を担当する技官の網本智子氏の助言やサポートを得ながら進めていきたいと考えている。
【Exp.2】については、現在ほとんど全ての酵素遺伝子について全長cDNAが得られつつあるので、クローニングが済み次第、順次、培養細胞用発現ベクターを構築し、タンパク発現・酵素活性測定を進めていきたい。
これらの実験と同時並行的に、研究実施計画でH29年度に予定している【Exp.3】のreal-time PCR法による各遺伝子の発現解析などの実験を進めていきたい。また、【Exp.4】のTAMの曝露実験にも取りかかりたい。
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| Causes of Carryover |
H28年度中の計画に含まれていた【Exp.1】「LC-MS/MSを用いたIAA関連物質(TAM, IAAなど)の分析」については、ACQUITY UPLC-TQD (Waters)を用いた予備実験では良好な結果が得られなかったため、内在性IAA関連物質の定量に至らなかった。内在性IAA関連物質の定量には重水素ラベルした合成品を購入する予定であるが、その分の必要経費は未使用のままであるため、H29年度に繰り越した。
また、【Exp.2】「培養細胞系を用いた生合成酵素タンパク質の発現」については、まだ全ての酵素遺伝子の全長cDNAが得られていないため、発現実験に進めていない。それらの実験に必要経費分は未使用のままであるため、H29年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度中に実施できなかった【Exp.1】「LC-MS/MSを用いたIAA関連物質の分析」については、広島大学自然科学研究支援開発センターのLTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific)を用いる予定であるので、そのための機器使用料、消耗品、試薬類（重水素ラベル化試薬など）の経費として使用する。同じく、H28年度中に実施できなかった【Exp.2】「培養細胞系を用いた生合成酵素タンパク質の発現」については、細胞培養用の培地、消耗品、試薬類の経費として使用する。
これらに加えて、H29年度の研究計画で予定している【Exp.3】「IAA生合成酵素群の発現解析」のための消耗品、試薬類、抗体作成委託の経費として使用する。同じく、H29年度に実施予定の【Exp.4】「ポリプ化活性物質TAMの曝露実験」のための飼育用器具類・飼料、消耗品、試薬類の経費として使用する。
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Research Products
(2 results)
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[Journal Article] Molecular characterization of aspartylglucosaminidase, a lysosomal hydrolase upregulated during strobilation in the moon jellyfish, Aurelia aurita.2017
Author(s)
Tsujita,N., Kuwahara,H., Koyama,H., Yanaka,N., Arakawa,K., Kuniyoshi,H.
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Journal Title
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
Volume: 81
Pages: 938-950
DOI
Peer Reviewed
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