樹木細胞壁の木化に及ぼす非セルロース性多糖類の影響

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14956
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 吉永 新 京都大学, 農学研究科, 准教授 (60273489)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上高原 浩 京都大学, 農学研究科, 教授 (10293911)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 引張あて材 / G層 / 師部繊維 / ペルオキシダーゼ / 木化 / リグニン / ヘミセルロース / キシラン

Outline of Annual Research Achievements

H30年度は、人為的木化におけるキシロオリゴ糖添加の影響を明らかにするために、モノクローナル抗体による免疫蛍光標識法を用いてキシラン分布とリグニン中の結合様式の分布を調べた。カジノキの師部、形成中の木部から50ミクロン厚さの横断面切片を作製し、リン酸緩衝液で繰り返し洗浄して可溶性のペルオキシダーゼを除去した。キシロオリゴ糖（市販）の70％エタノール溶液で切片を処理し、洗浄後、切片にコニフェリルアルコールと過酸化水素を加え、師部繊維のG層と引張あて材のG層の人為的木化を試みた。過酸化水素や、キシロオリゴ糖を含まない場合をコントロールとした。反応後の切片をエタノールで繰り返し洗浄して、低分子の重合物を除去した後、一部の切片をエポキシ樹脂に包埋した。包埋試料から厚さ0.5ミクロンの薄切片を作製し、抗キシランモノクローナル抗体、申請者が作製したリグニン中の8-5'型、8-8'型、8-O-4'型構造に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて免疫蛍光標識して、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、無処理の切片において、師部および木部のG層には抗キシラン抗体の標識は見られなかった。このことから、G層へのキシラン吸着の有無を抗キシラン抗体を用いた免疫蛍光標識法で確認できることが明らかになった。一方、師部及び木部のG層に抗8-8'型抗体のごく弱い標識が見られた。さらに、抗8-O-4'型抗体の標識がG層全体にほぼ均一に見られた。このことから、無処理の師部繊維および木部繊維のG層においても8-8'型及び8-O-4'型で結合したごく微量のリグニンまたはリグニン様物質が存在する可能性が示唆された。このことは、キシロオリゴ糖の添加が形成されるリグニンの化学構造にどのような影響を及ぼすかについて明らかにするためには、もともとG層に存在するリグニンの存在を考慮する必要があることを示唆している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本研究は、ペルオキシダーゼ活性を持つ引張あて材のG層と師部繊維のG層に非セルロース性多糖類を加えて吸着させた後、モノリグノールと過酸化水素を加えて人為的木化を試み、細胞壁の木化及びリグニンの化学構造に及ぼす非セルロース性多糖類の影響を明らかにすることを目的としている。
H28年度には、まずG層の人為的木化に先立ち、ペルオキシダーゼ活性が師部繊維のG層にも存在すること、2年間人為的に傾斜したカジノキでは、傾斜した年に形成された引張あて材のG層が翌年にもその活性を保持していること、その活性は試料を凍結保存しても保持されることをペルオキシダーゼの活性染色によって明らかにした。また、キシロオリゴ糖溶液を添加すると、特に師部繊維のG層にキシロオリゴ糖が吸着することをモノクローナル抗体による免疫蛍光標識法を用いて明らかにした。また、その吸着には適切なキシロオリゴ糖溶液の濃度が存在することを明らかにした。
H29年度には、カジノキ引張あて材の横断面切片を用いて、キシロオリゴ糖を吸着させた後にコニフェリルアルコールと過酸化水素を加えることにより、引張あて材のG層と師部繊維のG層の人為的木化を試みた。その結果、G層、特に師部繊維のG層に脱水素重合物が形成され、しかもその重合物はエタノール脱水によってもG層中に保持されることが示された。さらにキシロオリゴ糖の吸着によって、G層に形成される脱水素重合物が増加することを見出した。
H30年度には、人為的に木化させる前のカジノキ引張あて材について、モノクローナル抗体による免疫蛍光標識法によりキシランとリグニン中の8-5'型、8-8'型、8-O-4'型構造の分布を調べた。その結果、G層にキシランが存在しないこと、G層に8-8'型、8-O-4'型構造を持つごく微量のリグニンが存在することを見出した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度、モノクローナル抗体を用いた免疫蛍光標識法によって、これまでリグニンがほとんど存在しないと考えられてきたG層に8-O-4'型で結合したごく微量のリグニンが存在することが示唆された。このことはこれまでに報告されていない新しい情報であるので、G層を超音波処理により単離し、化学分析によりどのくらいの量のリグニンが存在するかを、NMR分析によってどのような結合様式を持ったリグニンが存在するのかを明らかにする必要がある。予想されるリグニンの量は微量のため、大量のG層を単離する必要がある。本研究の目的である、人為的木化に及ぼすキシロオリゴ糖添加の影響について明らかにするには、コントロール（無処理）との比較が重要となる。今回、免疫蛍光標識法によりコントロールにもG層に2種類の抗リグニン抗体の標識が見られたため、標識強度の比較をする必要があるが、蛍光強度の比較は退色の影響から難しい。そこで、蛍光標識二次抗体の代わりに酵素標識二次抗体を用いて、発色基質を加えて発色させ、吸収波長のバンドパスフィルターを用いて画像化し、画像の濃度から標識強度を比較する評価系を確立する。また、樹木細胞壁に存在するキシランはアセチル化されていることが知られている。そこで、条件を変えてアセチル化したキシロオリゴ糖を用いて、これまでと同様の実験を行い、G層の木化及び形成されるリグニンの化学構造に及ぼすキシランのアセチル化度の影響を明らかにする。

Causes of Carryover

理由　当初の計画では、G層にリグニンが存在しないという前提で進めていたが、今回G層にリグニンが微量存在することがわかり、G層の単離と化学分析によるG層中のリグニンの有無の確認と、抗体を用いた標識強度の評価系を確立する必要が生じたため。
使用計画　G層の単離とリグニン分析、キシロオリゴ糖またはキシランのアセチル化用の試薬、NMR分析およびMALDI-TOF MS用の試薬、器具などに使用する。