2017 Fiscal Year Research-status Report
バキュロウイルス遺伝子導入系の魚類生殖生理研究における利用技術開発
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16K14979
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90425421)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | バキュロウイルス / ウナギ / ティラピア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１、濾胞刺激ホルモン（FSH）強制発現ベクターの作製と培養細胞におけるFSH産生分泌の確認：昨年度検討したウナギFSH pFastBac-FSH強制発現ベクターは、ヒト胎児腎細胞由来HEK293T細胞に導入したものの培養液に分泌ウナギFSHは検出されなかった。そこで、高密度培養が可能な浮遊細胞系HEK293Free細胞にベクターを導入したが、やはり培養液にはFSHは分泌されなかった。いずれも、細胞抽出サンプルでは多量のウナギFSHが産生されていることは確認されたため、分泌に問題があると考えられた。そこで、過去にティラピア組換えFSH作製の際に使用したpCAGGSベクターに、ウナギFSHβとαサブユニットをリンカー配列で連結したcDNAを挿入し、それをHEK293Free細胞に導入したところ、培養液に多量のウナギFSHが検出された。pCAGGSベクターのAGプロモーターとウナギFSHの組合せで産生された組換えFSHは分泌されると考えられたことから、AGプロモーターからウナギFSHの配列全体をpFastBacのCMVプロモーター配列と入れ替えることで、分泌性ウナギFSH産生バキュロウイルスが作製できると予想された。
２、分泌性ウナギFSH産生バキュロウイルス作製に手間取っているため、GFP発現バキュロウイルスの作製を進めた。GFP配列が組み込まれたpFastBac-GFPを大腸菌DH10Bacに化学的にトランスフォーメーションしたがGFPが組み込まれたバクミドは得られなかった。試行錯誤を繰り返した後、エレクトロポレーション用に新たにDH10Bacを調整し、電気的にトランスフォーメーションを行ったところ、GFPが組み込まれたバクミドをようやく得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１、昨年度、pFastBacそのものにウナギFSHを挿入した強制発現ベクターを構築したものの、ベクターを導入した細胞培養液にFSHは分泌されなかった。リンカーを介した立体構造により分泌されない可能性を考え、各サブユニットが個別に転写される強制発現ベクターを作製して、培養細胞に導入して分泌の確認を繰り返した。しかし、結局分泌性ウナギFSH強制発現pFastBacを完成することはできなかった。そこで、pFastBacとは異なる強制発現プロモーターを持つpCAGGSベクターを用い、ようやく分泌性組換えウナギFSHを得ることができた。現在、pCAGGS-FSHベクターからプロモーター配列ごとpFastBacと入れ替えることで、分泌性ウナギFSH強制発現改造pFastBacが構築されると考え入替え作業を行っているものの、pFastBacの改造に予想以上に時間がかかっている。
２、バキュロウイルスの作製：バキュロウイルスの作製には目的遺伝子を導入したバクミドを得る必要がある。バクミド作製には業者から購入したDH10Bacを用い、プロトコルに従い化学的トランスフォーメーション法で導入を試みたが何度繰り返しても組換えバクミドは得られなかった。DH10Bacにはトランスポゼースをコードするヘルパープラスミドの存在も確認されたため、組換えが生じない理由はわからなかった。そこで、より多量の外来遺伝子導入が得られる電気的トランスフォーメーション法を試行した。まず、電気的トランスフォーメーション用のDH10Bacを作製し、それにpFastBac-GFPを電気的に導入したところ、ようやく組換えGFP導入バクミドを得ることができた。
以上、１、２、ともに、試行錯誤を重ねざるを得なかったことで当初予定から遅れることとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
１、分泌性FSH発現バキュロウイスルの作製：pCAGGS-FSHからプロモーターごとpFastBacに移入する。pFastBac-GFPをバクミドに挿入した方法を踏襲し、ウナギFSH-バクミドを作製する。FSH-バクミドをSf-9細胞に導入し、ウナギFSH-バキュロウイルスを作製する。FSH-バキュロウイルスをトランスポゾン-バキュロウイルスと供にEK1細胞に感染させ、３~４世代細胞を植え継ぎ、大量の分泌性ウナギFSH産生EK1細胞を得る。
２、FSH産生EK1細胞をウナギ腹腔内に移植する。FSHの産生は血液をサンプルとしたイムノブロット法で検証する。FSHの産生が確認されれば、産生が継続する期間を定期的な血液採取によって検討する。FSH産生が低下すればさらにFSH産生EK1細胞を移植する。卵黄形成の誘導が完了するまで続ける。
３、GFP強制発現バキュロウイルスを利用して、ティラピア培養精巣への導入、ティラピア受精卵へインフェクションを試行する。精巣培養では薄切した器官培養した場合にどの程度内部までGFPの導入が可能かを検討する。ティラピア精巣へのGFP導入が成功すれば、さらにサクラマス培養顆粒膜細胞への導入が可能かどうかを実験的に検証する。受精卵へのインフェクションでは、まずは受精卵外側からインフェクションを行い胚へのGFP導入が可能かどうかを検証する。胚へ導入されない場合は、顕微注射によって囲卵腔へバキュロウイルスを注入し、胚へのGFP導入を検討する。胚への導入が成功すれば、現在の受精卵への顕微注射をバキュロウイルス経由に技術転換することを検討する。
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Research Products
(1 results)
