バキュロウイルス遺伝子導入系の魚類生殖生理研究における利用技術開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K14979
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 井尻 成保 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90425421)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: バキュロウイルス / ウナギ / 濾胞刺激ホルモン / ティラピア

Outline of Annual Research Achievements

１、濾胞刺激ホルモン（FSH）強制発現ベクターの作製と培養細胞におけるFSH産生分泌の確認およびウナギFSH発現バキュロウイルスの作製：CMVプロモーターを持つ、ウナギFSH pFastBac-FSH強制発現ベクターは、HEK293T細胞に導入したものの培養液に分泌ウナギFSHは検出されなかったため、昨年度、AGプロモーターを持つpCAGGSベクターに、ウナギFSHβとαサブユニットをリンカー配列で連結したcDNAを挿入したコンストラクトを作製した。それをHEK293Free細胞に導入したところ、培養液に多量のウナギFSHが検出された。pCAGGSベクターのAGプロモーターとウナギFSHの組合せで産生された組換えFSHは分泌されることが確認されたことから、AGプロモーターからウナギFSHの配列全体をpFastBacのCMVプロモーター配列と入れ替えたコンストラクトを作製し（AG-FSH-pFastBac）、HEK293T細胞に導入したところ、ウエスタンブロット解析で培養液へのウナギFSHの分泌が確認された。このAG-FSH-pFastBacをバクミド（バキュロウイルスゲノム）を持つ大腸菌DH10Bacに形質転換し、その中からAG-FSHが組み込まれたバクミドを作製することに成功した。
２、GFP発現バキュロウイルスの作製：昨年度GFP配列が組み込まれたpFastBac-GFPを大腸菌DH10Bacに形質転換し、GFPが組み込まれたバクミドを得た。GFP-バクミドを精製し、ヨトウガ由来のSf9細胞に導入し、GFP強制発現バキュロウイルスを作製した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

pFastBacにウナギFSH配列を組込み培養細胞に導入しても、細胞中にはウナギFSHの産生が認められたものの、培養液には分泌されないという問題の克服に時間がかかった。試行錯誤に時間がかかったが、pFastBacに含まれるCMVプロモターをpCAGGSベクターから切り出したAGプロモーターに交換し、その下流にウナギFSHを組み込むことで組換えウナギFSHが培養液に分泌されるコンストラクトを作製することに成功した。pFastBacの改造は容易ではなく、トライアンドエラーを繰り返し、コンストラクト完成までに1年を要した。コンストラクト作製に想定以上に時間がかかってしまったことが研究計画が遅れている一番大きな理由である。このため、研究期間を1年延長し、次年度にAG-FSHを含むバキュロウイルスを作製し、それを介してウナギEK1細胞へのAG-FSHの導入を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

１、分泌性FSH発現バキュロウイスルの作製：AG-ウナギFSH-バクミドは作製した。来年度はAG-FSH-バクミドをSf-9細胞に導入し、ウナギFSH-バキュロウイルスを作製する。FSH-バキュロウイルスをトランスポゾン-バキュロウイルスと供にEK1細胞に感染させ、３～４世代細胞を植え継ぎ、培養液にバキュロウイルスが存在しないことを確認するとともに、大量分泌性ウナギFSH産生EK1細胞を作製する。
２、FSH産生EK1細胞をウナギ腹腔内に移植する。FSHの産生は移植後ウナギの血液をサンプルとしたイムノブロット法で検証する。FSHの産生が確認されれば、産生が継続する期間を定期的な血液採取によって検討する。FSH産生が低下すればさらにFSH産生EK1細胞を移植する。移植1ケ月後にサンプリングし、性成熟が誘導されたか否かを組織学的に解析する。
２、GFP強制発現バキュロウイルスを利用して、ティラピア培養精巣への導入、ティラピア受精卵へインフェクションを試行する。精巣培養では薄切した精巣を器官培養した場合にどの程度内部までGFPの導入が可能かを検討する。受精卵への遺伝子導入の検討では、まず、受精卵の卵膜除去条件を検討し、卵膜除去が可能になればバキュロウイルスをインフェクションし、胚へのGFP導入が可能かどうかを検証する。胚への導入が成功すれば、現行法の受精卵への顕微注射をバキュロウイルス経由に技術転換することを検討する。

Causes of Carryover

細胞外へ分泌するFSH強制発現ベクターの作製に時間がかかり、予定していたウナギFSH発現バキュロウイルスの作製、ウナギEK1細胞へのインフェクションによる遺伝子導入、およびウナギFSH強制発現EK1細胞の作製、およびそのウナギ生体への移植実験が行えなかったため、それらに関わる試薬、消耗品の購入を行わなかった。研究期間を1年延長し、上記の研究課題を来年度実行する。細胞培養液、トランスフェクション試薬、ウナギ血清のイムノブロット解析用試薬、組織学的解析消耗品に次年度使用額を用いる。