2017 Fiscal Year Research-status Report
親魚への腹腔内注射でゲノム編集する新技術の開発－多様な養殖魚への応用を目指して－
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16K14980
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
鈴木 徹 東北大学, 農学研究科, 教授 (70344330)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇治 督 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主任研究員 (40372049)
横井 勇人 東北大学, 農学研究科, 助教 (40569729)
木下 政人 京都大学, 農学研究科, 助教 (60263125)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 水産増養殖 / ゲノム編集 / 遺伝子導入 / 腹腔内注射 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPR-Cas9法は、ゲノム塩基配列を任意に書き変えことができるゲノム編集技術で、これにより魚類でも遺伝子破壊やノックインが可能となった。CRISPR-Cas9の応用は、水産養殖分野では高成長等の新品種作出が期待されているが、実用化への最大のネックは、ゲノム編集操作を行ったF0からホモ変異体を作出するまでに3世代の交配が必要で、養殖対象魚種では6年以上を要することである。本研究では、新品種作出に要する時間を大幅に短縮することを目的として、成熟雌親魚への腹腔内注射により、CRISPR-Cas9法のコンストラクトを卵巣内の卵母細胞に導入する技術を開発し、F0でホモ変異体を作出する技術の開発を目指す。現時点では、guide RNAとCas9配列を組み込んだベクターを腹腔内注射して卵母細胞に導入し、ゲノム編集することを計画している。
昨年度、エレクトロポレーション法で電気的にベクターを卵母細胞に導入することを検討したが、卵母細胞を覆う濾胞細胞が障壁となり、ベクターは卵母細胞に導入できないこと判定された。本年度は、ビテロジェニン(Vg)中のVg受容体との結合配列(ゼブラフィッシュでは、HLTKTKD)を含むキャリアペプチドを合成し、これを媒介に使ってプラスミドを卵母細胞に導入することを検討した。緑色蛍光試薬で標識したキャリアペプチド(HLTKTKDLGGGGRRRRR)を合成し、ペプチドのみを雌に注射したところ、卵母細胞が強い緑色蛍光で標識され、得られた受精卵も標識された。この結果は、Vgキャリアペプチドが卵母細胞に特異的に取り込まれることを示している。現在、遺伝子導入試薬であるLipofectamineを使ってVgキャリアペプチドとベクターとのコンジュゲートを合成し、それを腹腔に注射してベクターを卵母細胞に導入することを検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、Vgエレクトロポレーション法でプラスミドを卵母細胞に導入することを試みたが、実用化には至らなかった。本年度にキャリアペプチドが非常に効率的に卵母細胞に取り込まれることを発見したことは、本研究の最終目的である「親魚への腹腔内注射でゲノム編集する新技術の開発」に向けた大きな突破口となるものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度、Vgキャリアペプチドの卵母細胞への導入の有効性が示されたので、これを媒介としてCRISPR-Cas9ベクターを導入する条件を検討する。導入条件が確立されたら、実際の遺伝子改変用ベクターを卵母細胞に導入して、ゲノム編集を試みる。これまでの実験では、モデル生物であるゼブラフィッシュを用いているので、さらに海産魚のササウシノシタを使って実験を行い、海産養殖魚への応用の道を検討する。
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