2016 Fiscal Year Research-status Report
インタラクトーム解析で切り拓く魚類補体成分の血液外での新機能同定
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16K14985
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
中尾 実樹 九州大学, 農学研究院, 教授 (50212080)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 免疫 / 生体防御 / 補体 / 体表 / インタラクト―ム / 魚類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、魚類体表粘液での補体成分の存在状態をタンパク質レベルで検証するために、下記のように、抗原の調製、抗体の作成、および補体成分の検出の予備的検討を進めた。
I.抗体の作成---C3およびC4アイソタイプ:NativeコイC3アイソタイプ(C3-H1、C3-S)は既報(Nakao et al., Eur J Immunol. 2000 Mar;30(3):858-6 6) の方法によりコイ血清から精製し、常法によりウサギでポリクローナル抗体を作成した。一方、C4-1およびC4-2アイソタイプについては、Netrinドメイ ンをHisTag付き組換えタンパク質として発現させ、ウサギでポリクローナル抗体を作成した。C7アイソタイプ：C7-1およびC7-2アイソタイプのFIMACドメインをGSTとの融合蛋白質として大腸菌orgami B で発現させ、ラットでポリクローナル抗体を作成後、GST固定化カラムによって、交差反応を吸収除去した特異抗体を精製した。Pfアイソタイプ：Pf-1およびPf-2のTSR4-6ドメインをHisタグ付き組換え体として発現させ、SDS-PAGEで精製後、ウサギでポリクローナル抗体を作成した。
II.粘液中の補体成分検出---コイ体表粘液を集め、これをSuperdex200カラムで分画後、各フラクションを濃縮し、上記抗体を用いたウエスタンブロッティングに供試した。抗原の検出には、ペルオキシダーゼ標識二次抗体と化学発光基質を用い、ケミルミイメージャーで特異的なバンドを同定した。
III.相互作用解析の予備的検討---QCMによる相互作用の網羅的解析法に加えて、リガンド固相化カラムとウエスタンブロッティングを用いた、新規解析法を考案し、その最適委条件を設定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
補体タンパク質の検出に用いる抗体の作成およびそれら抗体を用いた検出条件がほぼ確立できた。特に化学発光による超高感度ウエスタンブロッティングは、体表粘液中の補体成分の検出・同定に効果的であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
相互作用分析については、当初予定したQCMよりもさらに高感度な方法を検討中であり、今後その応用が期待される状態である。すなわち、片方の相互作用リガンドをアガロースビーズに固定化して微小カラムに充填し、これに対応するリガンド溶液を流して溶出液を分取し、溶出液中のリガンドを高感度ウエスタンブロッティングで検出する。これにより、精製補体成分が用意できなくても相互作用解析を行うことが可能となり、また、比較的弱い相互作用も高感度に検出することができる。今後は、本法を広く適用することで、体表粘液中の補体成分との相互作用物質を探索する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究において、コイ補体成分C2に対する抗体作製を進めてきたが、ウサギへの免疫原の免疫期間が予定よりも長引いたために、納品がH28年度末に間に合わなかったために、免疫受託料金の支払いが次年度となったことが、残金が生じた理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
抗コイC2ウサギ抗血清が納品（4月中）され次第、その委託料金を支払う予定である。（約4.5万円）
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Research Products
(1 results)
