2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K15040
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| Research Institution | Azabu University |
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Principal Investigator |
池田 輝雄 麻布大学, 獣医学部, 准教授 (60151297)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マクロファージ / 脂質ラフト / 自然免疫 / 炎症 / スフィンゴ糖脂質 / シグナル伝達 / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、平成28年度に行った結果と一部相反する結果を得たので、追加の検証実験を実施した。野生型マクロファージ（WT Mφ）およびGM3 合成酵素ノックアウトマウスマクロファージ(GM3KOMφ)の増殖や主要な表面マーカー分子発現には前年度同様に差異が認められなかった。しかしながら、免疫グログリン標識ビーズの貪食率および大腸菌殺菌率は、WT Mφに比べ GM3KOMφでは有意に亢進されていた。さらに、一酸化窒素（NO）およびスーパーオキサイド産生においてもWT Mφに比べGM3KOMφでは有意な増加が認められた。同様に、リポ多糖（LPS）刺激における前炎症性サイトカイン誘導（TNF-α、IL-6、およびIL-1β）でも、mRNA発現は野生型に比べGM3KOマウス腹腔マクロファージでは有意な増加が認められた。同様に、これら前炎症性サイトカインのタンパク産生も、WT Mφに比べGM3KOMφでは有意な増加が認められた。上記のGM3KOMφで見られた前炎症性サイトカイン産生増加の細胞内メカニズムの解析を目的として、細胞内シグナル関連分子の動態を検討したところ、LPS刺激GM3KOMφでは、NFκ―B経路のRelAおよびIκBの発現解析からWT Mφに比べシグナル伝達分子の活性亢進が認められた。さらに、ERK、JNK、およびp38のリン酸化の発現レベルでも同様に、LPS刺激後のWT Mφに比べGM3KOMφでは発現レベルが増加したことから、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路の活性化もGMの欠損によって強く誘導されることが確認された。平成29年度は、GM3がサイトカイン産生およびその産生に関与するシグナル伝達経路を抑制していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ガングリオシド系列のスフィンゴ糖脂質合成酵素の遺伝子欠損マウスの競合実験が多く行われているため、実験に必要なマウスの供給が不足しているため、計画よりもやや進捗が遅れている。さらに、平成２８年度に実施したサイトカイン実験の追加実験を行い、前回と異なる結果がでたため、その確認実験に時間と要したが、それについては確認が取れた。細胞供給の安定化のため、マクロファージの細胞株であるRaw264.7での遺伝子編集を用いたGM3合成酵素欠損株のクローニングを実施しているが、現在までクローンが得られていないことも進捗の遅れている原因となっている。現在、プロモーターを変えてのクローニング選択を実行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度に報告したGM3合成酵素KOマウスでのマクロファージ機能抑制は認められず、LPSなどのPAMPｓ刺激においてはサイトカインの遺伝子発現および蛋白発現はむしろ促進していた事が、H２９年度の検証実験により明らかとなった。さらに、LPS刺激におけるシグナル伝達分子の動態を検討したところ、転写因子であるNFκBおよびAP-1の上流でのシグナル関連分子の発現が促進されていた。今後は、影響することがすでに分かっている接着因子の発現レベルなどを解析する予定である。さらに、GM3に焦点をあて、Raw264.7でのGM3ｓ欠損クローンを作成し、これまで確認された同様な現象が見られるかを検討する。また、GM3の添加により、GM#欠損による機能回復するとの報告もあることから、これまで検討した結果がGM3添加によってどのように変化するかも検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
細胞培養のための、サイトカインの購入を申請したが金額が残額を超えていたため次年度購入にしたために18333円の差異が生じた。
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Research Products
(3 results)
