2018 Fiscal Year Research-status Report

Identification of host factors to prevent the emergence of highly pathogenic avian influenza virus

Research Project

Project/Area Number	16K15041
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	酒井宏治国立感染症研究所, ウイルス第三部, 主任研究官 (70515535)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	インフルエンザAウイルス / 高病原性化 / HA / 開裂 / 変異 / 宿主プロテアーゼ / 野生水禽 / 家禽
Outline of Annual Research Achievements	インフルエンザAウイルス（IAV）の感染性獲得には、ウイルス膜蛋白質のHAがプロテアーゼにより蛋白質分解性の修飾（HAの開裂）を受け、膜融合活性を発現する必要がある。IAVは自身でプロテアーゼ遺伝子を持たないため、HAを開裂できる宿主プロテアーゼを借用する必要があり、IAV増殖場所はそのプロテアーゼが存在する組織に限定される。野生水禽から発育鶏卵で分離した低病原性株（HA開裂部位はmono-basicなアミノ酸配列）H7N1ウイルス（鶏で非病原性）及びその野生型マウス馴化株を用い、野生型マウスとTmprss2 KOマウスにおける感染実験において、野生水禽由来mono-basic H7N1ウイルスの生体内でのウイルス増殖、その後の病原性発現にTmprss2が必須の宿主因子であることを明らかにした。この事象は、これまでの申請者らの研究で明らかとなった季節性インフルエンザウイルスH1N1やH3N2と同様の結果であり、ヒトウイルスだけでなくトリウイルスにも共通原理であることが示唆された。これまでの研究において、H3N2ウイルスの場合、TMPRSS2遺伝子欠損マウスでの連続継代後、本来はTMPRSS2依存性（TMPRSS2遺伝子欠損マウスで非病原性）であったウイルスが、HAに1アミノ酸変異（糖鎖欠失）を伴い、TMPRSS2遺伝子欠損マウスでHA開裂を起こす、病原性ウイルスに変異した。H7N1マウス馴化株についても、同様に、TMPRSS2遺伝子欠損マウスでの連続継代により、TMPRSS2遺伝子欠損マウスで病原性を示すTMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化H7N1ウイルスが得られた。これまで、TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化過程のどの段階で、どのような変異が起こったか、継代毎のマウス感染肺から得られたウイルス遺伝子配列について、サンガー法により、詳細に配列決定を実施し、これまで得られた次世代シーケンサーとの比較を合わせて実施した。また、野生水禽（マガモ）や家禽（鶏）のTMPRSS2等によるH7N1ウイルスのHA開裂能機能解析も実施した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化H7N1ウイルスの鶏での病原性試験を実施することが出来なかった。昨年度、H7N1ウイルスの野生型マウス馴化株、TMPRSS2遺伝子欠損マウス継代毎での馴化株のウイルスゲノムの比較解析を次世代シーケンサーで実施したところ、5つのウイルス遺伝子において、12か所のアミノ酸変異が認められた。一方、次世代シーケンサーでは、同時に10サンプル以上のサンプル調整を独立して実施しなかった為、クロスコンタミと考えられる変異も同時に認められた（サンガー法の解析では、親株である野生型マウスでは認められなかったアミノ酸配列が認められた）。そこで、次世代シーケンサーでの解析の検証のため、TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化株のサンガー法での解析も、実施した。TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化で得られた変異は、昨年度と同様であるが、野生型マウス馴化株で認められた一部のアミノ酸配列については、TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化株からのクロスコンタミと考えられた。
Strategy for Future Research Activity	（1）TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化H7N1ウイルスの病原性解析 TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化H7N1ウイルスの鶏での病原性試験により、本来鶏で非病原性であったウイルスの病原性が、TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化により、どのように変化したのか明らかにする。ただし、これまでの報告より、鶏での高病原性化は、全てアミノ酸挿入であり、アミノ酸置換ではない。アミノ酸挿入によりは、構造学的にHA開裂部位領域が露出し、複数のプロテアーゼとの物理的接触が可能になると推測している。本研究での観察されたHA開裂部位へのアミノ酸置換での高病原性化は報告されていないことから、鶏での病原性は低病原性が推測される。（2）研究のとりまとめこれまでの得られた研究成果を科学論文に投稿するための論文作成作業を実施する。
Causes of Carryover	TMPRSS2遺伝子欠損マウス馴化H7N1ウイルスの鶏での病原性試験等を実施することが出来なかった。また、それに伴い、研究成果のとりまとめに遅延が生じた。したがって、これらの研究の実施及び研究とりまとめを実施する。