イヌの皮膚線維芽細胞から肝細胞への直接分化誘導法の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15050
• Research Institution: Azabu University
• Principal Investigator: 久末 正晴 麻布大学, 獣医学部, 准教授 (80333144)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: イヌ / 肝細胞 / 幹細胞 / 分化誘導 / ダイレクトリプログラミング / 骨髄

Outline of Annual Research Achievements

近年、iPS細胞による再生医療実施が期待されているが実際には倫理面や高いコストの問題で実施は極めて困難である。iPS細胞は、線維芽細胞から一度未分化な細胞へリセットして目的の臓器への分化を行うが、臓器によっては組織中の幹細胞から直接形質転換する方がはるかに安全かつ迅速で早期に臨床応用できる。そこで本研究では、ダイレクト・リプログラミング法を用いて、イヌの皮膚線維芽細胞から肝臓細胞への分化誘導系の確立を目指し、イヌの重度肝疾患における低コスト、低侵襲の再生医療の基盤技術を創出する。
平成28年度は、イヌ皮膚線維芽細胞を分離・培養した。その後パッケージング細胞であるPlatinum-A Retroviral Packaging Cell Line(PLAT-A)にて肝細胞の分化に関連した2つの転写因子であるHnf4αとForkhead box(Fox)遺伝子をレトロウイルスベクターに。得られたレトロウイルスを用いて遺伝子導入し、肝細胞誘導用の培地(DMEMおよびF12)にて、効率の良い分化誘導の条件検討を行った。その結果、皮膚由来の間葉系幹細胞からの分化では多数の未分化細胞のコロニーが出現し、形態的に肝前駆細胞に類似した細胞が多数認められた。ただし、これら細胞の出現は少数かつ一過性であったため培養検討の見直し等を行っている。
また、分化誘導のソースとして骨髄由来の間葉系幹細胞からのダイレクトリプログラミングも現在予備検討を行っている。その結果、皮膚由来の間葉系幹細胞からの分化では形態的に肝前駆細胞および肝様細胞に類似した細胞が認められた。現在は、これら2種類の細胞を中心に培養条件等の調整を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

アルブミンの発現解析等までは踏み込めていないものの、皮膚由来および骨髄由来の細胞から肝様細胞への分化への条件検討は次第に出来つつある。今後、状況によっては脂肪由来幹細胞に対する検討や培養安定化のために三次元培養を試みる可能性がある。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度はアルブミン遺伝子のmRNA発現量を基に、肝細胞への分化誘導に適切な条件を検討しつつ、CD44、AFP、CD29およびCD90など肝前駆細胞にけるマーカー2が発現しているか検討する。これらの分化誘導実験には、ダイレクト・プログラミング研究の第一人者である鈴木淳史先生、さらにレトロウイルスベクターの作製には理化学研究所にてベクター作製に熟練した村上裕信先生に研究協力者として加わっていただき技術指導を受ける。さらに、マイクロアレイにて線維芽細胞、正常肝細胞、および分化誘導細胞の遺伝子発現レベルを網羅的に解析する。機能解析は、糖新生（PAS染色）、脂質代謝(LDL合成)、解毒作用(CYP代謝活性)、および尿素産生の評価(アンモニア添加)によって詳細に検討する3。また、これら解析が順調にゆけばCCl4によって誘導した肝障害モデルイヌ（又はイヌ化モデルNOGマウス）に対して移植実験を実施し治療効果を判定する。

平成30年度は平成29年度より引き続き、分化誘導細胞の性状および機能解析を実施する。また、CCl4誘導肝障害モデル動物（犬もしくはイヌ化モデルNOGマウス）を用いて、蛍光標識した分化誘導細胞を用いた移植実験を実施し治療効果を判定する。

Causes of Carryover

H28年度中にアルブミン発現を含む遺伝子発現解析まで実施できなかったこともあり、リアルタイムPCRの実験費用を次年度へ繰り越した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

H29年度中にアルブミン発現を含む遺伝子発現解析を実施予定である。