新規ニューロトレーサーウイルスと組織透明化技術を用いた単独神経回路可視化法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15059
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 谷口 隆秀 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (70282803)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ウイルス / 神経回路 / コネクトーム解析 / イメージング / 発光タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、安全なニューロトレーサーウイルスとしての組換えPHEV 67N株作製とPHEV検出系確立のため、Nタンパク質の各種発現系・検出系の開発を進めた。齧歯類神経細胞高親和性株 PHEV 67N 岩手株のNタンパク質遺伝子をクローニングし、大腸菌発現系を用いて組換えPHEV 67N 株Nタンパク質の大量発現系を作製した。作製した組換えNタンパク質を抗原として抗PHEV Nタンパク質モノクローナル抗体(MAb)の作製を継続して実施している。また、作製した組換えPHEV Nタンパク質を用いて抗PHEV Nタンパク質抗体を高感度に検出可能なELISA法を確立した。
PHEV Nタンパク質遺伝子を、EF1αプロモーターを持つ哺乳類細胞発現ベクターに組み込み、FS-L3細胞に遺伝子導入し、PHEV Nタンパク質を発現する細胞株を作製した。さらに神経細胞へ分化するPC12細胞へのPHEV Nタンパク質遺伝子導入を継続して進めている。
PHEV 67N 岩手株のウイルスゲノム3’領域 9 kb を複数のウイルスゲノム断片としてRT-PCRにより増幅した。今後ウイルスゲノム断片を結合して連続した 9kb ウイルスゲノム断片を作製し、発光タンパク質遺伝子を組み込む最適な部位を決定する。齧歯類神経細胞高親和性67N株と非親和性ONS204株のウイルスゲノム塩基配列を比較したところ、発光タンパク質組み込み部位の１候補であるns2遺伝子においてONS204株で大きな欠失が確認されたことから、ns2遺伝子の機能・感染細胞での発現様態を調べるため、大腸菌発現系により組換えns2タンパク質を作製し、組換えns2タンパク質を抗原として抗ns2ポリクローナル抗体を作製した。作製した抗ns2抗体を用いてPHEV感染細胞でのns2の発現様態について研究祖進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

PHEV Nタンパク質の大腸菌発現系による組み換えタンパク質の作製、組み換えNタンパク質を用いたELISA法による抗PHEV 抗体検出法の開発、PHEV Nタンパク質を発現する哺乳類培養細胞の作製など、概ね予定通り進行した。一方で、抗PHEV Nタンパク質モノクローナル抗体の作製に当初予想より時間がかかっており、また、発光タンパク質遺伝子挿入部位の候補であるns2 遺伝子に大きな変異が確認されたことから、新たにns2遺伝子産物の発現様態や機能の解析などの実験を進めている。そのため、神経細胞特異的プロモーターを用いたPHEV Nタンパク質発現系の開発が遅れている。PHEV Nタンパク質モノクローナル抗体の作製も進んでおり、ns2 に関する実験も順調に進んでいることから、平成29年は予定通り、1)「神経細胞特異的プロモーター制御によるPEDV 67N株 Nタンパク質発現PC12細胞の作製の継続実施」。2)「相同組換えシステムによる高輝度発光タンパク質遺伝子導入PHEV 67N 組換えウイルス株の作製の継続実施」を予定通り進行させることができものと考えている。

Strategy for Future Research Activity

神経細胞特異的プロモーター制御によるPEDV 67N株 Nタンパク質発現PC12細胞の作製を継続、神経細胞特異的にPHEV Nタンパク質を発現させる発現系の開発を進める。
相同組換えシステムによる高輝度発光タンパク質遺伝子導入PHEV 67N 組換えウイルス株の作製を継続して実施する。まず、最も一般的に使用されるGFP-1 遺伝子を組み込んだPHEV 67N 株を作製する。
作製した発光タンパク質遺伝子が組み込まれた組換えPHEV 67N 株（ニューロトレーサーウイルス）の、FS-L3細胞およびPC12細胞などの培養細胞系での感染・増殖とGFPなどの発光を確認する。同時に、マウス脳スライス培養系を用いてに対し in vitro で新規作製 ニューロトレーサーウイルスを感染させ、中枢神経組織におけるニューロトレーサーウイルスの動態について解析を進める。

Causes of Carryover

購入予定であったティッシュチョッパー ML-100と同等製品の McIlwain ティッシュチョッパーを低価格で英国から導入することができたため、また、データの蓄積が始まったばかりで学会発表や論文投稿に係わる経費を使用しなかったため次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究が進んできており、今後新たな実験に使用する消耗品や試薬類の購入が増えることが予想される。また、学会発表や論文投稿関連費用も発生することから、次年度使用額もそれらの増加分に当てる。