新規ニューロトレーサーウイルスと組織透明化技術を用いた単独神経回路可視化法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15059
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 谷口 隆秀 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (70282803)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ウイルス / 神経回路 / コネクトーム解析 / イメージング / 発光タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

げっ歯類神経細胞への適応によるためか PHEV 67N株の様々な細胞株への感染性が変化していることが明らかとなったため、当初使用予定であったネココロナウイルス株とfcwf-4細胞が相同組換え実験に適していないことが明らかとなった。昨年度は、ウイルスゲノム相同組換えに適した新たな細胞株の選定実験を多数の培養細胞株を用いて実施し、相同組換えに適した細胞株に選定することによって、培養細胞株を変更することで対応可能なことを確認した。今年度はより効率的に相同組換えを行えると予想されるレシピエントウイルス株と培養細胞株の組み合わせについて検討した。PHEウイルスの相同組換え実験により適したウイルス株と細胞株を選抜できたことから、今後効率よく発光タンパク質遺伝子導入PHEV組換えウイルス株の作製を進めることが可能となった。
また、PHEVを安定的に増殖させ、正確にウイルス力価を判定できるよう、PHEV 感受性細胞株（FS-L3株）の詳細な培養条件を検討し、PHEVの増殖・力価測定に適した細胞クローンをクローニングし、培養条件を確定した。
併せて、安全なニューロトレーサーウイルスとしての組換えPHEV 67N株作製とPHEV検出系確立のため、Nタンパク質と合わせてHEタンパク質の各種発現系・検出系を開発した。齧歯類神経細胞高親和性株 PHEV 67N 岩手株のNタンパク質遺伝子を元に大腸菌発現系を用いた組換えPHEV 67N 株Nタンパク質、HEタンパク質を作製し、抗PHEV NおよびHEタンパク質抗体を高感度に検出可能なELISA法を確立した。現在、わが国におけるPHEV感染症に対する疫学調査を継続して実施中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2018年4月頃から豚血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（PHEV）の増殖・ウイルス力価測定に必須である培養細胞（FS-L3細胞）の増殖が悪化し、実験に支障をきたすようになった。本研究に用いるPHEVに感受性のある細胞株は極めて少なく、新たに入手することが困難なため、細胞ストックを解凍・再培養し、培地・試薬等を新たに購入するなどしたが改善せず、細胞培養系を研究に使用可能な状態に戻すために約8か月を要した。そのために研究の進捗が大幅に遅れてしまった。
また、相同組換えによる発光タンパク質遺伝子導入組換えウイルス株の作製に使用する予定であったfcwf-4細胞（ネコマクロファージ系株化細胞）に対するPHEV67株の感染性が変化したため、相同組換え実験に使用することができず、実験に使用可能な新たな細胞株の選定に時間を費やすこととなった。
これらの理由により、発光タンパク質遺伝子導入PHEV 67N 組換えウイルス株の作製開始が大幅に遅れることとなった。多くの細胞株を用いて検討した結果、相同組換え実験に適したウイルス株と細胞株を確定できたこと、またFS-L3細胞の性状が研究継続可能な状態に回復したことから、今後、相同組換えシステムによる高輝度発光タンパク質遺伝子導入PHEV 67N 組換えウイルス株の作製とニューロトレーシング解析を再開し、進めることができものと考えている。

Strategy for Future Research Activity

ウイルスの増殖・力価測定に必須であるFS-L3細胞の性状が研究継続可能な状態に回復したことから、相同組換えシステムによる高輝度発光タンパク質遺伝子導入PHEV 67N 組換えウイルス株の作製を継続して実施する。CrFK細胞とType IIネコ腸コロナウイルス 79-1683株を用いた相同組換えにより、GFP-1等の蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだPHEV 67N 株を作製する。
その後、蛍光タンパク遺伝子導入PHEV 67N 株（ニューロトレーサーウイルス）の、FS-L3細胞およびPC12細胞などの株化培養細胞系での感染・増殖とGFPなどの蛍光を確認する。同時に、マウス神経系初代培養細胞及びマウス脳スライス培養系に対し in vitro で新規作製 ニューロトレーサーウイルスを感染させ、中枢神経組織におけるニューロトレーサーウイルスの動態について解析を進める。さらに、マウス脳透明化技術を用いて、脳全体を検体として蛍光実体顕微鏡下での神経接続のトレーシングを検討する。
並行して、神経細胞特異的プロモーター制御によるPEDV 67N株 Nタンパク質発現PC12細胞, neuro-2a細胞の作製、神経細胞特異的にPHEV Nタンパク質を発現させる発現系の開発を継続する。

Causes of Carryover

2018年4月頃から研究に使用している培養細胞の発育が徐々に悪くなり、実験に支障をきたすようになった。そこで、液体窒素タンクに保存してあった細胞ストックを解凍・再培養し、また細胞培養に使用する培地・試薬等を新たに購入し直すなどしたが改善しなかった。本研究に使用する豚血球凝集性脳脊髄炎ウイルスが感染・増殖する培養細胞株は極めて少なく、細胞のクローニングや抗生物質処理などにより細胞培養系を研究に使用可能な状態戻すために8か月近くかかってしまったために、研究の進捗が大幅に遅れてしまった。そのため、次年度使用額が生じ、また補助期間延長を申請し承認された。
（使用計画）2019年度が期間延長による最終年度であり、次年度使用額は作製の遅れている「相同組換えシステムによる高輝度発光タンパク質遺伝子導入PHEV 67N 組換えウイルス株」の作製と解析に当てる。