2018 Fiscal Year Research-status Report
単為生殖虫を標的としたゲノム編集法の確立とそれに基づく昆虫細胞内共生系の基盤解明
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16K15067
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
中鉢 淳 豊橋技術科学大学, エレクトロニクス先端融合研究所, 准教授 (40332267)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エンドウヒゲナガアブラムシ / 共生関連遺伝子 / ゲノム編集 / CRISPR-Cas9 / 単為生殖虫 / エレクトロポレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画の目標は、CRISPR/Cas9システムに立脚し、生体エレクトロポレーションにより核酸導入効率を最大化することで、エンドウヒゲナガアブラムシ単為生殖虫の生殖系列を標的としたゲノム編集法を確立することである。平成２８年度には、生体エレクトロポレーションの条件を検討するとともに、共生細菌Buchneraの分裂制御に関わると目されるX1遺伝子に対応するgRNAおよびCas9 mRNAを調製した。平成２９年度は、得られたgRNAとCas9 mRNAを単為生殖雌成虫の血体腔内にCellTram vario（Eppendorf）システムを用いてインジェクトし、生体エレクトロポレーションにより細胞内への取込促進を図った後、次世代虫での変異の導入効率を検証したが、変異の導入された個体は得られなかった。これを踏まえ、平成３０年度は、生体エレクトロポレーションの条件を再検討するとともに、ゲノム編集についてより多くの試行を重ねた。変異の検出については、gRNAとCas9 mRNA投与虫より産出された幼虫各個体より触覚の一部を切除して個別にゲノムDNAを抽出し、変異導入の標的配列を含む領域をPCR増幅ののち、産物を変性・アニーリングし、Guide-it Resolvase（Clontech/Takara）による切断処理後、アガロースゲル電気泳動により切断の有無、すなわち変異導入の有無を判定した。変異導入個体が検出された際は、同個体やその子孫について、タンパク質X1に対する免疫組織化学をはじめとする各種解析を行うことで、共生系への影響を精査する予定であるが、これまでのところ変異の導入された個体は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
実験作業は当初計画に基づき遂行されているものの、現在までのところ変異の導入された個体が得られていない。このため、計画は遅れていると判断せざるを得ない。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験の各過程について条件を再検討するとともに、より多くの試行を重ねることで、変異導入個体の獲得を目指す。
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| Causes of Carryover |
慎重な予算執行を心がけたため。
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