2017 Fiscal Year Research-status Report
昆虫脚再生における幹細胞群形成の時空間的制御機構の解明
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16K15068
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
石丸 善康 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 助教 (50435525)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 再生 / 脱分化 / マクロファージ / CRISPR/Cas / RNAi / JAK/STAT / コオロギ / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
再生モデル昆虫であるフタホシコオロギを用い、脚再生の初期過程におけるDecapentaplegic(Dpp)シグナル径路の関与について解析を行った。先に我々は、フタホシコオロギの脚形成の開始と遠近軸に沿ったパターン形成において、発生と再生でHedgehog(Hh)やWingless(Wg)など共通の因子が利用されていることを明らかにしてきた。脚の再生過程では、これらの因子の働きにより傷口の修復後に切断部位の最も遠位に位置価が付与され、切断部位付近の遠近軸が再パターニングされる。また、再生の初期過程ではdppも発現しており、再生脚の遠近軸形成に必要と考えられるが、RNA干渉法(RNAi)を用いた機能解析で再生脚への影響は確認されなかった。そこで、Dppシグナル伝達物質であるSmad タンパク質(Mad）に着目し、RNAiを用いてその機能を解析した。その結果、mad RNAiにより附節が再生しないことが明らかとなり、再生脚の遠位端（再生芽）形成の開始にDppシグナル経路が関与することが示唆された。一方、再生脚の脛節において、より遠位方向への伸長が確認されたことから、脛節の遠位方向の伸長抑制とサイズ調節にもDppシグナル経路が関与している可能性が示唆された。また、これら附節と脛節における結果は、DppのTypeⅠ受容体に対するRNAi解析でも同様の結果であることが確認された。従って、Dppシグナル経路が再生脚の最遠位形成と遠近軸に沿った位置情報の維持に関与しており、位置情報に基づいた遠位方向への再生脚伸長の制御に必須であることがわかった。今後、再生の初期において再生芽の形成に関与することが示唆されるマクロファージ様細胞におけるHh、Wg、Dppシグナル径路への関与を解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
CRISPR/Casゲノム編集法を利用してSTAT遺伝子座にGFPノックインを行い、再生芽を構成する未分化幹細胞群を特定し、再生芽の形成様式の可視化を目指している。そのため、コオロギにおいて正確かつ高効率な遺伝子挿入技術が必要であり、PITCh（Precise Integration into Target Chromosome：標的染色体領域への正確な遺伝子挿入）システムを用いたマイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)による新たな遺伝子ノックイン技術の確立を試みた。現在、PITChシステム確立のため、従来の非相同末端結合(NHEJ)を介したGFPドナーベクターのノックイン実験が先行して結果が得られているabd-A遺伝子を標的として、abd-A のC末端にGFPタグを付加したAbd-A―GFP融合タンパクとして発現するノックインコオロギ作製を検討した。PITChシステムのため、abd-Aに対して約20塩基対ほどの相同配列を付加したGFPドナーベクターを構築し、abd-A 遺伝子座へのGFPノックインを行ったが、まだ期待された成果が得られ始めた段階で、さらなるPITChシステム構築のため検討が必要である。そのため、やや遅れていると判断した。
また、筋肉の再生にサテライト細胞が関与することが示唆されているが、どのようにサテライト細胞が活性化されて筋肉細胞に分化するのか解析を進めている。現在、脊椎動物における筋肉サテライト細胞のマーカー遺伝子Pax3/7に対するコオロギの相同遺伝子gooseberry1/2の単離に成功しており、RNAiを用いて筋肉再生への影響を解析中で、こちらはおおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）PITChシステムを利用した遺伝子ノックイン技術の確立を引き続いて検討する。この方法により、STAT遺伝子座にGFPをノックインさせた系統を樹立して、GFP蛍光ラベルにより未分化幹細胞群を特定することで、再生芽の時間的空間的な形成様式を可視化可能であると考えている。さらに、再生芽形成への関与が示唆されるマクロファージ様細胞に殺細胞効果を示すクロドロン酸処理した脚と正常な再生脚とでGFPラベルした未分化幹細胞群の挙動を比較検討する。
２）CRISPR/Casゲノム編集を利用し、筋肉サテライト細胞のマーカー遺伝子gooseberry1/2のノックアウトコオロギを作製して筋肉再生への影響について解析を行う予定である。また、PITChシステムを用いてgooseberry遺伝子座にGFPをノックインすることで筋肉サテライト細胞をラベルして、その局在を調べる。さらに、サテライト細胞の分化誘導にマクロファージ様細胞が関与するかを調べるためにクロドロン酸処理を行い、サテライト細胞の挙動を同様に解析することでコオロギ脚再生における筋肉再生のメカニズム解明が期待される。
３）クロドロン酸処理した再生脚と正常な再生脚における遺伝子発現を比較するため次世代シークエンスによるRNA-Seq解析を行う。その解析結果より再生芽形成に必須な候補遺伝子を同定し、RNAiやCRISPR/Casによるノックアウトを行うことで再生への影響を解析していく予定である。
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| Causes of Carryover |
研究を進めていく上で、未分化幹細胞群へのGFPノックイン系統の作製を優先し遂行しているため、当初予定していたRNA-Seq解析が遅れており、29年度の研究費に未使用額が生じたが、研究計画に変更はなく前年度の研究費も含め、今年度行う予定の研究計画と併せて実施する。
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