2017 Fiscal Year Research-status Report
ヘルペスウイルスLATmiRNAを利用したCRISPRCasシステムと遺伝子治療
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16K15093
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
岡田 尚巳 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (00326828)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮川 世志幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (90415604)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ヘルペスウイルス / 脊髄小脳変性症 / CRISPR-dCas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに作製したCACNA1A 遺伝子発現抑制系の評価を行った。本評価のためにCACNA1A 遺伝子5’UTR領域とルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーター発現プラスミドを構築した。同プラスミドを前年度に作製したCACNA1A 遺伝子5’UTR領域標的sgRNA及びCRISPRiに用いるヌクレアーゼ活性が欠損しているdCas9発現プラスミドと同時に培養細胞に遺伝子導入し、CACNA1A 遺伝子発現抑制効果を検証した。その結果、複数デザインしたCACNA1A 遺伝子5’UTR領域標的sgRNAのうち、２つのsgRNAについてはコントロールと比較し、有意にCACNA1A 遺伝子5’UTRの転写活性を抑制することが明らかとなった。従って、上記で発現抑制効果を確認したCRISPR-dCas9システム発現コンストラクトの無毒化HSVゲノムへの組み込みを試みた。Gateway technologyを用いてCRISPR-Cas9発現カセットの無毒化HSVベクターへの組み込みを行うために、まず上記で評価したCACNA1A 遺伝子5’UTR領域標的sgRNA発現カセット、dCas9及びにレポーター遺伝子発現カセットをGateway technologyのシャトルベクターであるpENTRプラスミドにクローニングを行い、All-in-oneシャトルベクターを構築した。一方で、無毒化HSVゲノムにGateway technologyの組換え配列であるattR1-attR2に挿入した無毒化HSV-GWを作製した。組換え配列は無毒化HSVゲノム上で恒常的に転写活性が高いLAT領域、あるいは神経特異的に転写活性が高いTerminal repeat領域に挿入された。同システムを利用し、LAT領域に対してCRISPRiカセットを組み込んだCRISPRi-LATHSVの構築まで完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の実施計画は、CACNA1A 遺伝子標的CRISPR-dCas9システムの機能評価及び同システムを搭載した無毒化HSVの構築・機能解析であった。上記の通り、CACNA1A遺伝子標的CRISPR-dCas9システムの機能評価に必要なレポーターアッセイ系の構築・利用により、効果的にCACNA1A遺伝子発現抑制を行うことができるsgRNAの選定を終了し、それを用いたCRISPRi発現系構築は完了した。一方、サイズの大きいCRISPR-dCas9システム発現コンストラクトのウイルスゲノムへの挿入は試行錯誤により多少の時間を要したが、Gateway technologyの利用により、これを解決した。作製したCRISPRi-HSVベクターの動作確認・機能評価について、現在解析を進めている。従って、今年度の研究計画については概ね予定通り進んだと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進として、まず今年度作製を行ったCRISPRi-HSVベクターの機能評価についてin vitroの系で解析を進める。具体的にはラット神経細胞初代培養系（後根神経節・中枢神経由来神経細胞）に対する遺伝子導入実験、同培養系を用いたCACNA1A 遺伝子発現抑制試験を計画している。in vitroで発現抑制効果が確認されたら、in vivoにて同ベクターの機能性を評価する。標的疾患である脊髄小脳変性症６型モデルマウスは同患者と類似した表現系（小脳プルキンエ細胞における神経細胞の脱落及び変性、神経細胞内における変異タンパク質の凝集、また運動機能障害）が観察される。従って本研究で作成した治療ベクター（CRISPRi-HSVベクター）の機能評価は同疾患モデルマウスを用いて行う。加えて、TR領域に対してCRISPRiカセットを組み込んだCRISPRi-LATHSVの構築し、CRISPRi-LATHSVと発現量・機能性について比較を行う。同時に正常型CACNA1A遺伝子供給のための発現系の構築・CRISPRi 発現系とHSVmiRNAの組換えも並行して試み、CRISPRi-HSVベクターの性能向上を図る。
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| Causes of Carryover |
CRISPR-dCas9システムを搭載した無毒化HSVベクターの構築を行い、その機能評価をin vitro/in vivoにおけるレポーター解析及びqPCR・免疫染色による発現解析にて進めているが、現在その一部がまだ解析中であり、それらに必要な経費が余剰として生じている。
今年度は、CRISPR-dCas9システム搭載無毒化HSVの機能評価について速やかに解析を進め、結果を得る。
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