タンパク質相互作用に基づくペプチドリガンドの設計とプロテインノックダウンへの応用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15121
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 内藤 幹彦 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 部長 (00198011)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大岡 伸通 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 室長 (80568519)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ペプチド / 核内受容体

Outline of Annual Research Achievements

これまでの研究で、エストロゲン受容体に対して強い親和性（Kd値：13nM）で結合するヘリカルペプチド（PERM3）を開発した。膜透過性を高めるためにPERM3のC末に膜透過ペプチド（R7）を結合し、さらにN末には各種リンカーを介してIAPリガンド（MV1）を結合したペプチド型SNIPERを各種合成した。これらのペプチド型SNIPERをin vitroでMCF7ヒト乳がん細胞に６時間作用させてエストロゲン受容体の発現量の変化をWesternブロット法で評価した結果、PEGリンカー（n=2）を介してMV1とPERM3-R7を結合したペプチド型SNIPER（peptide４）、及びAlaリンカーを介してMV1とPERM3-R7を結合したペプチド型SNIPER（peptide５）がエストロゲン受容体の減少活性を示す事を見出した。PERM3はアンドロゲン受容体にも結合活性を示す事から、アンドロゲン受容体の減少活性を同様にして調べたところ、これらのペプチド型SNIPERはアンドロゲン受容体の減少活性も示す事がわかった。またこれらの核内受容体減少活性は、プロテアソーム阻害剤であるMG132で抑制された事から、これらのペプチド型SNIPERはユビキチン・プロテアソーム系による標的タンパク質の分解を誘導している事が示唆された。これらの結果から、ヘリカルペプチドを標的リガンドとして利用したペプチド型SNIPERによって標的タンパク質の分解を誘導できることが示された。しかし小分子リガンドを利用したSNIPERに比べて活性が弱いことから、細胞への透過性などを改善する必要があると思われた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

エストロゲン受容体及びアンドロゲン受容体の分解誘導活性を持つペプチド型SNIPERの開発に成功した。

Strategy for Future Research Activity

ペプチド型SNIPERによって標的タンパク質に形成されたユビキチン鎖の性状をTUBE（Tandem Ubiquitin Biding Entity）を利用してMSで解析すると共に、siRNAによってIAPを発現抑制した細胞で標的タンパク質のユビキチン化とプロテアソームによる分解が阻害されているかどうかを調べ、標的タンパク質のプロテインノックダウンが想定通りIAPによるユビキチン化を介しているかどうか検討する。さらにこれらタンパク質の分解が下流のシグナル経路に与える影響を検討する為に、エストロゲン受容体によって転写活性化される事が知られているサイクリンD、Myc、pS2等の遺伝子発現を定量的RT-PCRで解析する。また乳がん細胞、前立腺がん細胞の増殖阻害活性をMTTアッセイで測定し、細胞死誘導活性をフローサイトメーター及びカスパーゼ活性化等の方法で測定する。

Causes of Carryover

当該年度の研究計画を主に年度の後半に実施したが、第４四半期に執行した経費の支払いが遅れているため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の予定通り、物品費（試薬及び消耗品等の購入）、及び研究成果発表のための旅費等に研究費を使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Targeted Degradation of Proteins Localized in Subcellular Compartments by Hybrid Small Molecules (2017)
  • Author(s): Keiichiro Okuhira, Takuji Shoda, Risa Omura, Nobumichi Ohoka, Takayuki Hattori, Norihito Shibata, Yosuke Demizu, Ryo Sugihara, Asato Ichino, Haruka Kawahara, Yukihiro Itoh, Minoru Ishikawa, Yuichi Hashimoto, Masaaki Kurihara, Susumu Itoh, Hiroyuki Saito and Mikihiko Naito
  • Journal Title: Mol Pharmacol Volume: 91 Pages: 159-166
  • DOI: 10.1124/mol.116.105569
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] In Vivo Knockdown of Pathogenic Proteins via Specific and Nongenetic Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP)-dependent Protein Erasers (SNIPERs) (2017)
  • Author(s): Nobumichi Ohoka, Keiichiro Okuhira, Masahiro Ito, Katsunori Nagai, Norihito Shibata, Takayuki Hattori, Osamu Ujikawa, Kenichiro Shimokawa, Osamu Sano, Ryokichi Koyama, Hisashi Fujita, Mika Teratani, Hirokazu Matsumoto, Yasuhiro Imaeda, Hiroshi Nara, Nobuo Cho, Mikihiko Naito
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 292 Pages: 4556-4570
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.768853
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Development of a peptide-based inducer of nuclear receptors degradation (2016)
  • Author(s): Yosuke Demizu, Nobumichi Ohoka, Takaya Nagakubo, Hiroko Yamashita, Takashi Misawa, Keiichiro Okuhira, Mikihiko Naito, and Masaaki Kurihara
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Lett Volume: 26 Pages: 2655-2658
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2016.04.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of BCR-ABL degradation inducers via the conjugation of an imatinib derivative and a cIAP1 ligand (2016)
  • Author(s): Yosuke Demizu, Norihito Shibata, Takayuki Hattori, Nobumichi Ohoka, Hiromi Motoi, Takashi Misawa, Takuji Shoda, Mikihiko Naito, and Masaaki Kurihara
  • Journal Title: Bioorg Med Chem Lett Volume: 26 Pages: 4865-4869
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2016.09.041
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] ユビキチン・プロテアソーム経路を利用したプロテインノックダウン化合物の開発 (2017)
  • Author(s): 大岡伸通、永井克典、奥平桂一郎、柴田識人、服部隆行、長展生、内藤幹彦
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-25 – 2017-03-27
• [Presentation] プロテインノックダウン法を利用したアンドロゲン受容体蛋白質分解誘導剤の開発 (2017)
  • Author(s): 柴田識人、大岡伸通、服部隆行、永井克典、伊東昌宏、奈良洋、長展生、内藤幹彦
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-25 – 2017-03-27
• [Presentation] ユビキチンープロテアソーム系を介したHisタグタンパク質分解誘導分子の開発 (2017)
  • Author(s): 沖津航陽，服部隆行，出水庸介，三澤隆史，正田卓司，内藤幹彦，栗原正明
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2017-03-25 – 2017-03-27
• [Presentation] In vivo protein knockdown by SNIPER recruiting IAP ubiquitin ligases (2016)
  • Author(s): Mikihiko Naito
  • Organizer: The 21th 国際化学療法シンポジウム
  • Place of Presentation: 日本科学未来館（東京）
  • Year and Date: 2016-12-14 – 2016-12-15
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Development of hybrid small molecules that induce degradation of oncogenic BCR-ABL (2016)
  • Author(s): Norihito Shibata, Nobumichi Ohoka, Takayuki Hattori, Mikihiko Naito
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [Presentation] 低分子化合物SNIPERによるin vivoプロテインノックダウンと抗腫瘍活性評価 (2016)
  • Author(s): 大岡伸通、奥平桂一郎、永井克典、伊東昌宏、柴田識人、服部隆行、宇治川治、佐野修、小山亮吉、今枝泰宏、奈良洋、長展生、内藤幹彦
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 横浜国際会議場（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [Presentation] 低分子化合物SNIPERによるin vivoプロテインノックダウン (2016)
  • Author(s): 大岡伸通、奥平桂一郎、柴田識人、服部隆行、内藤幹彦
  • Organizer: 第20回日本がん分子標的治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 別府コンベンションセンター（大分県別府市）
  • Year and Date: 2016-05-30 – 2016-06-01
• [Presentation] エストロゲン受容体分解誘導剤の分子デザイン (2016)
  • Author(s): 正田卓司，奥平桂一郎，内藤幹彦，栗原正明
  • Organizer: 第20回日本がん分子標的治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 別府コンベンションセンター（大分県別府市）
  • Year and Date: 2016-05-30 – 2016-06-01
• [Remarks] 国立医薬品食品衛生研究所遺伝子医薬部 研究概要
  • URL: http://www.nihs.go.jp/mtgt/research.html