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2016 Fiscal Year Research-status Report

貪食細胞におけるサイレントカリウムチャネルのon-off スイッチング機構の解明

Research Project

Project/Area Number 16K15127
Research InstitutionNagoya City University

Principal Investigator

鈴木 良明  名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 助教 (80707555)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2018-03-31
Keywords薬理学 / 薬学 / 生体分子 / 生物物理 / 免疫
Outline of Annual Research Achievements

マクロファージ(Mφ)は自然免疫系において非常に重要な役割を担っている。Mφの主な機能として、生体外から侵入した異物の貪食作用、貪食した異物の情報を他の免疫細胞に伝える抗原提示作用、他の免疫細胞の活性化をコントロールするサイトカインの産生作用などが挙げられる。Mφは一連の免疫応答を引き起こすために、細胞外の環境変化を感知し、細胞内に情報を伝達する多様な機構を備えている。この情報伝達機構の一つに、イオンチャネルによる細胞膜電位の制御がある。我々は、pH、温度、機械刺激など、多様な細胞外刺激によって活性化・不活性化を引き起こし、細胞膜電位を制御するTwo-pore-domain K+(K2P)チャネルに着目した。本研究では、Mφに発現する主要なK2Pサブファミリーを同定し、Mφ機能への寄与を明らかにすることを目的とした。
①発現解析の結果、TWIK-1のmRNAおよびタンパク質レベルでの発現が検出された。
②TWIK-1は持続的にエンドサイトーシスを受けるため、細胞膜発現が不安定であることが報告されている。そこで、TWIK1の細胞外ドメインを認識する抗体を用いて、非膜透過処理下で染色したところ、意外なことにTWIK-1がマウス腹腔Mφの細胞膜上に安定的に発現することが明らかになった。
③ホールセルパッチクランプ法により膜電流を測定したところ、想定されるK+電流は検出されなかった。細胞外のK+を除くと、TWIK-1は非選択的陽イオンチャネルとして機能することが知られている。そこで、0 mM K+条件下で膜電流を測定したところ、非選択的な陽イオン電流が検出された。この電流はshTWIK-1によるノックダウンにより有意に減少した。
以上より、TWIK-1はMφにおいて非選択的な陽イオンチャネルとして機能し、細胞膜のイオン輸送を介して多様なシグナル伝達に寄与している可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①定量的PCR、ウエスタンブロッティング、免疫染色法などの多方面からの発現解析の結果、腹腔マクロファージにおいてTWIK-1が発現することを初めて明らかにした。また先行研究の結果に基づく予想とは反して、TWIK-1が細胞膜上に局在することを明らかにした。今後、蛍光ビーズや粒子状物質の貪食によって細胞膜発現量あるいはエンドサイトーシス効率の変化などを解析する。

②ホールセルパッチクランプ法により、TWIK-1がK+チャネルとしてではなくむしろ非選択的陽イオンチャネルとして機能することを示唆するユニークな結果が得られた。今後細胞外環境によるイオン選択性の変化や細胞膜電位に対する影響を明らかにする。

③レンチウイルスによる遺伝子導入系の立ち上げに概ね成功した。これによりshRNAの導入によるTWIK-1のノックダウンが可能になり、選択的な阻害薬が存在しないTWIK-1の機能的解析を行うことができるようになった。しかし、ウイルスのタイターに依然ばらつきがあるため、プロトコールをより簡素化・統一する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

①細胞膜電位に対する影響の解析:TWIK-1の細胞膜発現が明らかになったが、そのイオンチャネルとしての機能は不明な点が多い。0 mM K+条件下の非選択的陽イオン電流に加えて、K+をRb+に置換した際のRb+電流も測定し、TWIK-1の機能発現をより明らかにする。また、pHなど細胞外環境の変化によるイオン選択性に対する影響を明らかにする。さらに、細胞膜電位に対するTWIK-1の寄与をパッチクランプ法や膜電位感受性色素を用いた実験により明らかにする。

②各種炎症性サイトカイン産生に対する影響の解析:LPSやTNFαなどで刺激した際の各種サイトカイン産生に対するTWIK-1の寄与を定量的PCRやELISA法によって明らかにする。特にATP刺激によって引き起こされるNLRP3インフラマソームの活性化(特に、膜電位変化や細胞内Ca2+濃度変化、IL-2産生量の変化など)に対する寄与を明らかにする。

③蛍光ビーズなどの粒子状物質で刺激した際のTWIK-1の細胞内局在の変化の解析:ATPのみならずシリカやアスベスト、尿酸結晶などの粒子状物質によっても炎症性サイトカインが産生されることが明らかにされている。そこで、蛍光ビーズや尿酸結晶、水酸化アルミニウムなどの粒子状物質で刺激した際のTWIK-1の細胞内局在や機能変化を明らかにする。またサイトカイン産生量の変化についても明らかにする。

Causes of Carryover

概ね計画通りに予算を執行することができた。
腹腔マクロファージの状態やレンチウイルスの性能・タイターが安定しないことがあったため、ELISA法によるサイトカイン産生量の検討が十分に行えず、使用額に差が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

より安定的な系で実験を行うため、骨髄由来マクロファージ(BMDM)を用いた実験系を立ち上げる。また、これまでに得られた結果が、チオグリコレート培地で誘導した腹腔マクロファージに特異的なものであるという可能性を排除するため、BMDMも含めた他種のマクロファージを用いてTWIK-1発現・機能を調べる。

  • Research Products

    (41 results)

All 2017 2016 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (6 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (32 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 2 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Int'l Joint Research] カルガリー大学(カナダ)

    • Country Name
      CANADA
    • Counterpart Institution
      カルガリー大学
  • [Journal Article] Molecular mechanisms underlying pimaric acid-induced modulation of voltage-gated K+ channels.2017

    • Author(s)
      Sakamoto K, Suzuki Y, Yamamura H, Ohya S, Muraki K, Imaizumi Y.
    • Journal Title

      J Pharmacol Sci.

      Volume: 133(4) Pages: 223-231.

    • DOI

      10.1016/j.jphs.2017.02.013.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ryanodine receptor type 3 does not contribute to contractions in the mouse myometrium regardless of pregnancy.2017

    • Author(s)
      Matsuki K, Takemoto M, Suzuki Y, Yamamura H, Ohya S, Takeshima H, Imaizumi Y.
    • Journal Title

      Pflugers Arch.

      Volume: 469(2): Pages: 313-326

    • DOI

      10.1007/s00424-016-1900-z

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 平滑筋Ca2+シグナルにおけるミトコンドリアとミトフュージンの生理的意義2017

    • Author(s)
      山村寿男、鈴木良明、今泉祐治
    • Journal Title

      日薬理誌

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

  • [Journal Article] Modulation of Ca2+ oscillation and melatonin secretion by BKCa channel activity in rat pinealocytes.2016

    • Author(s)
      Mizutani H, Yamamura H, Muramatsu M, Hagihara Y, Suzuki Y, Imaizumi Y.
    • Journal Title

      Am J Physiol Cell Physiol.

      Volume: 310(9) Pages: C740-7

    • DOI

      10.1152/ajpcell.00342.2015

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Hypoxic stress up-regulates Kir2.1 expression and facilitates cell proliferation in brain capillary endothelial cells.2016

    • Author(s)
      Yamamura H, Suzuki Y, Yamamura H, Asai K, Imaizumi Y.
    • Journal Title

      Biochem Biophys Res Commun.

      Volume: 476(4) Pages: 386-92

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2016.05.131

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] A new splice variant of large-conductance Ca2+ -activated K+ (BK) channel α subunit alters human chondrocyte function.2016

    • Author(s)
      Suzuki Y, Ohya S, Yamamura H, Giles WR, Imaizumi Y.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 291(46) Pages: 24247-60

    • DOI

      10.1074/jbc.M116.743302

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] 平滑筋Ca2+シグナルにおけるミトフュージン2の生理機能2017

    • Author(s)
      山村寿男、川崎桂輔、稲垣奏、鈴木良明、今泉祐治
    • Organizer
      第94回日本生理学会大会
    • Place of Presentation
      浜松
    • Year and Date
      2017-03-28
    • Invited
  • [Presentation] TASK1-TALK2異種2量体形成によるチャネル機能の多様化2017

    • Author(s)
      鈴木良明、堤香菜子、宮本達也、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      日本薬学会第137年会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2017-03-27
  • [Presentation] ラット松果体細胞においてCa2+活性化Cl-チャネルとして機能するTMEM16A/Bへテロ二量体2017

    • Author(s)
      萩原由実子、山村寿男、西村歌織、鈴木良明、今泉祐治
    • Organizer
      第137回日本薬学会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2017-03-27
  • [Presentation] 肝硬変門脈圧亢進症マウスの門脈平滑筋におけるTMEM16Aの機能発現低下2017

    • Author(s)
      古川奈美、山村寿男、鈴木良明、近藤るびい、今泉祐治
    • Organizer
      日本薬学会第137年会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2017-03-27
  • [Presentation] 血管平滑筋Ca2+マイクロドメインを構築する複合体分子基盤のナノイメージング解析2017

    • Author(s)
      佐伯尚紀、鈴木良明、山村寿男、竹島浩、今泉祐治
    • Organizer
      日本薬学会年会第137年会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2017-03-25
  • [Presentation] 軟骨細胞においてClC3チャネルは低浸透圧応答に関与する2017

    • Author(s)
      山田啓史、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-17
  • [Presentation] 2ポアドメインK+チャネルによるマウス腹腔マクロファージの膜電位形成2017

    • Author(s)
      山越大槻、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-17
  • [Presentation] BKチャネルαサブユニット新規スプライスバリアント体による軟骨細胞機能の修飾2017

    • Author(s)
      鈴木良明、大矢進、山村寿男、Wayne R. Giles、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-16
  • [Presentation] 血管平滑筋細胞においてジャンクトフィリン2はカベオラと筋小胞体間の効率的なCa2+シグナル伝達のためのCa2+マイクロドメインを構築する2017

    • Author(s)
      佐伯尚紀、鈴木良明、山村寿男、竹島浩、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-16
  • [Presentation] 改変遺伝子導入培養細胞系を用いたK2Pチャネル作用薬の新規高効率評価法の開発2017

    • Author(s)
      川﨑桂輔、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-16
  • [Presentation] 門脈圧亢進症におけるCa2+活性化Cl-チャネルTMEM16Aの発現低下2017

    • Author(s)
      山村寿男、近藤るびい、古川奈美、鈴木良明、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-16
    • Invited
  • [Presentation] 気管支平滑筋細胞におけるBKCaチャネルγ1サブユニットの生理機能解明2017

    • Author(s)
      野田さゆり、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-15
  • [Presentation] 脳血管内皮細胞において低酸素ストレスは、dynamin-2を介して細胞膜上のKir2.1発現量を増加させ、細胞増殖の亢進に寄与している2017

    • Author(s)
      山村 英斗、鈴木良明、山村寿男、浅井清文、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-15
  • [Presentation] Two-pore-domain K+チャネル TASK1、TALK2 の異種2量体形成の解明2017

    • Author(s)
      堤香菜子、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第90回日本薬理学会年会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2017-03-15
  • [Presentation] Hypoxic stress facilitates cell proliferation via Kir2.1 up-regulation in brain endothelial cells2017

    • Author(s)
      Hideto Yamamura, Yoshiaki Suzuki, Hisao Yamamura, Kiyofumi Asai, Yuji Imaizumi
    • Organizer
      Alberta-Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) workshop for medical innovation
    • Place of Presentation
      Calgary
    • Year and Date
      2017-02-24 – 2017-02-25
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Involvement of calcium related ion channels in inflammatory response in chondrocyte2017

    • Author(s)
      Yoshiaki Suzuki, Susumu Ohya, Hisao Yamamura, Wayne R. Giles, Yuji Imaizumi
    • Organizer
      Alberta-Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) workshop for medical innovation
    • Place of Presentation
      Calgary
    • Year and Date
      2017-02-24 – 2017-02-25
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 血管平滑筋の細胞内Ca2+動員機構制御に対する3型リアノジン受容体の関与2016

    • Author(s)
      松木克仁、加藤大樹、竹本将士、鈴木良明、山村寿男、大矢 進、竹島 浩、今泉祐治
    • Organizer
      第26回日本循環薬理学会
    • Place of Presentation
      松本
    • Year and Date
      2016-12-02
  • [Presentation] 脳虚血時を想定した低酸素ストレス負荷脳血管内皮細胞の細胞増殖に対するKir2.1の機能的役割2016

    • Author(s)
      山村英斗、鈴木良明、山村寿男、浅井清文、今泉祐治
    • Organizer
      第26回日本循環薬理学会
    • Place of Presentation
      松本
    • Year and Date
      2016-12-02
  • [Presentation] 軟骨細胞においてClC3チャネルは低浸透圧応答に関与する2016

    • Author(s)
      山田啓史、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第130回日本薬理学会近畿部会
    • Place of Presentation
      京都
    • Year and Date
      2016-11-19
  • [Presentation] 肝硬変由来門脈圧亢進症モデルマウスの門脈平滑筋におけるTMEM16Aチャネルの発現及び機能低下2016

    • Author(s)
      古川奈美、山村寿男、近藤るびい、鈴木良明、今泉祐治
    • Organizer
      第130回日本薬理学会近畿部会
    • Place of Presentation
      京都
    • Year and Date
      2016-11-19
  • [Presentation] 松果体のCa2+活性化Cl-チャネルとして構成するTMEM16A/Bへテロ二量体2016

    • Author(s)
      萩原由実子、山村寿男、西村歌織、鈴木良明、今泉祐治
    • Organizer
      第38回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2016-11-18
  • [Presentation] 血管平滑筋細胞においてカベオラと結合膜構造が構築するCa2+マイクロドメインのナノイメージング解析2016

    • Author(s)
      佐伯尚紀、鈴木良明、山村寿男、竹島浩、今泉祐治
    • Organizer
      第38回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2016-11-17
  • [Presentation] 2ポアドメインK+チャネルによるマウス腹腔マクロファージの膜電位形成2016

    • Author(s)
      山越大槻、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第38回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2016-11-17
  • [Presentation] 2ポアドメインK+チャネルのヘテロ2量体形成によるチャネル特性の変化2016

    • Author(s)
      堤香菜子、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      第38回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2016-11-17
  • [Presentation] 門脈平滑筋におけるTMEM16Aチャネルの生理機能と門脈圧亢進症での発現変化2016

    • Author(s)
      山村寿男、大城隼也、近藤るびい、古川奈美、鈴木良明、今泉祐治
    • Organizer
      生理学研究所研究会2016「心臓・血管系の包括的な機能統合研究」
    • Place of Presentation
      福岡
    • Year and Date
      2016-10-24
  • [Presentation] マウス気管支平滑筋におけるCa2+活性化K+チャネル修飾サブユニットγ1の生理機能解明2016

    • Author(s)
      野田さゆり、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      生体機能と創薬シンポジウム2016
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-08-25 – 2016-08-26
  • [Presentation] 軟骨細胞において低浸透圧応答に関与するCl-チャネルの機能解析2016

    • Author(s)
      山田啓史、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      次世代を担う創薬・医療薬理シンポジウム2016
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-08-24
  • [Presentation] 低酸素ストレス負荷脳血管内皮細胞の細胞増殖に対するKir2.1の役割2016

    • Author(s)
      山村英斗、鈴木良明、山村寿男、浅井清文、今泉祐治
    • Organizer
      次世代を担う創薬・医療薬理シンポジウム2016
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-08-24
  • [Presentation] 血管平滑筋においてカベオラとジャンクトフィリン2が形成するCa2+マイクロドメイン機構の解明2016

    • Author(s)
      佐伯尚紀、鈴木良明、山村寿男、竹島浩、今泉祐治
    • Organizer
      第58回日本平滑筋学会総会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-08-18 – 2016-08-19
  • [Presentation] Mitofusinによるミトコンドリア酸素・カルシウム制御機構の解明2016

    • Author(s)
      川﨑桂輔、鈴木良明、山村寿男、今泉祐治
    • Organizer
      オルガネラネットワークの制御機構とその生理的意義
    • Place of Presentation
      岡崎
    • Year and Date
      2016-07-28 – 2016-07-29
  • [Presentation] 血管平滑筋細胞において筋小胞体とカベオラの近接化によりCa2+マイクロドメインを形成するジャンクトフィリン2機能の解明2016

    • Author(s)
      佐伯尚紀、鈴木良明、山村寿男、竹島浩、今泉祐治
    • Organizer
      生理学研究所オルガネラ研究会2016「オルガネラネットワークの制御機構とその生理的意義」
    • Place of Presentation
      岡崎
    • Year and Date
      2016-07-28 – 2016-07-29
  • [Presentation] 血管平滑筋細胞のカベオラを中心とするCa2+マイクロドメイン形成におけるジャンクトフィリン2機能の解明2016

    • Author(s)
      佐伯尚紀、鈴木良明、山村寿男、竹島浩、今泉祐治
    • Organizer
      第129回日本薬理学会近畿部会
    • Place of Presentation
      広島
    • Year and Date
      2016-06-24
  • [Remarks] 名古屋市立大学 大学院薬学研究科 細胞分子薬効解析学分野 ホームページ

    • URL

      http://www.phar.nagoya-cu.ac.jp/hp/ysg/

  • [Patent(Industrial Property Rights)] イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング用材料及びその利用2016

    • Inventor(s)
      今泉祐治、山村寿男、鈴木良明、川崎桂輔、成田寛
    • Industrial Property Rights Holder
      今泉祐治、山村寿男、鈴木良明、川崎桂輔、成田寛
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2016-214685
    • Filing Date
      2016-11-01

URL: 

Published: 2018-01-16  

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