Development of useful medicinal plant using antibody-based technology

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K15131
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 森元 聡 九州大学, 薬学研究院, 教授 (60191045)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 宏幸 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (30253470) ; 坂元 政一 九州大学, 薬学研究院, 助教 (50610177)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: パーオキシダーゼ / コガネバナ / ケシ / 二次代謝産物

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度では、コガネバナパーオキシダーゼの組換え酵素を発現し、それを抗原としてマウスにインジェクションしたが、目的の抗体を得ることができなかった、そこで平成29年度は発現条件の検討を精査し、パーオキシダーゼ活性を有する組換え酵素の発現の検討を試みた。
コガネバナには3種のパーオキシダーゼイアソザイムが確認されているので、2種のパーオキシダーゼ（SP1及びSP2)の発現を試みた。SP1についてはすでに平成28年度で活性酵素の発現に成功しているので、SP2について検討した。SP2遺伝子を発現ベクターのpET21b（+）に導入し、これを用いて大腸菌株JM109の形質転換を行った。得られた発現菌株にIPTGを添加して18時間培養した結果、33kDa付近に目的の組換えタンパク質が発現していることを確認した。しかしながら発現したSP2は不溶性の不活性のタンパク質として発現したので、巻き戻しを行った。変性剤の尿素存在下で、組換えタンパク質を溶解し、酸化剤および還元剤としてシスタミンおよびシステアミンを加えて巻き戻しを行った。なおパーオキシダーゼはヘムタンパク質であるので、ヘミンも添加した。４℃で５日間静置した後、透析することにより、添加剤を除いた。巻き戻しSP2の酵素活性を測定した結果、パーオキシダーゼ活性を有することを確認した。
さらに平成29年度では、モルヒネの代謝に関するパーオキシダーゼ（OP1,OP2,OP3）を大腸菌で発現し、活性型酵素への巻き戻しにも成功している。現在、マウスへの免疫を検討中である。
また、平成29年度に調製した各コガネバナパーオキシダーゼをマウスに投与しており、抗体値を測定している。充分な抗体値が観察されれば、中和活性を有するモノクローナル抗体を作製する計画である。