リガンドポケットのない核内受容体に対する天然由来アゴニスト探索と活性化機序解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15135
• Research Institution: Musashino University
• Principal Investigator: 小谷 仁司 武蔵野大学, 薬学研究所, 助教 (10594640)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 核内受容体 / ヘテロダイマー / RXR / 天然物 / 自己免疫疾患 / 制御性T細胞 / NR4A2 / スクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

本研究では新たな核内受容体活性化の指標として、ヘテロダイマー活性化という点に着目し、リガンドポケットを持たない核内受容体の活性化制御をおこなうことを目的として研究を進めている。今年度は、スクリーニング系の作製を目的として、リガンドポケットを持たない核内受容体NR4A1,NR4A2の発現プラスミドのクローニングをおこなった。また、これまでに取得済みの核内受容体RXRの発現プラスミドと組み合わせてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。既存の合成RXRアゴニストを5種類ほどアッセイ系により評価をおこなったが、ヘテロダイマー活性化を示唆するRXRアゴニストは見いだせなかった。さらに、NR4A2の転写活性化が報告されている化合物を取得し、アッセイ系に加えたがその化合物に関しても直接的なヘテロダイマー活性化作用を見いだせなかった。本研究で用いているアッセイ系は、GAL4融合タンパクとしてNR4A2を発現し、GAL4結合配列を持つレポータープラスミドと一緒に、核内受容体RXRを強制発現するアッセイ系であり、RXRアゴニストによりNR4A2とのヘテロダイマーを形成し、転写活性化することを期待して作製したものである。これまで試した化合物は、RXRアゴニストとしての活性の報告があるものや、NR4A2の転写活性化を遺伝子発現などで確認した化合物であり、ヘテロダイマー活性化に関する報告は無いものである。また、NR4A2に関して同様なGAL4融合タンパクを用いたレポーターアッセイの報告を見つけ、XCT0135908という化合物が活性化するということがわかるとともに、市販されていないことから、この化合物の有機合成による作製をおこなっている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

探索に用いるアッセイ系の作製をおこなっているが、発現プラスミドの構築はできているのだが、ポジティブコントロールとすることができる化合物がないことが問題となっている。このような点からも挑戦的な研究内容になるのであるが、可能性がありそうな化合物に関しては、市販されていないことから、有機合成による作製という想定外の作業が入ってきたため、進捗状況としてはやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

現在合成中のXCT0135908を早急に取得し、アッセイ系による活性化の確認をおこなう。また、並行して生薬・植物抽出エキスの活性を前倒しで評価し、アッセイ系の活性化作用を持つエキスが無いかの検討もおこなうこととする。これらの検討をおこない、標的遺伝子発現の変化などをさらに評価することで、研究課題の推進を早めることができると考えている。

Causes of Carryover

年度末に学会参加があり、数日間実験を止める必要があるため、試薬類などの発注を次年度にまわしたことによる繰り越しであり、ほぼ計画通りに執行されていると考えている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に繰り越した予算に関しては、解析用の抗体や解析キットの購入などに使用する予定である。