2017 Fiscal Year Research-status Report

脳組織タンパク質の質量分析イメージングの高感度化に向けた技術開発

Research Project

Project/Area Number	16K15167
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	川岸将彦東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	寺田純雄東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022) 齊藤健太東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60374659) 佐藤啓介東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	質量分析 / 顕微鏡技術 / 脳・神経 / 細胞・組織 / タンパク質
Outline of Annual Research Achievements	1. 研究成果の内容: 質量分析イメージング(MSイメージング)とは、組織切片上で直接に質量分析を行うことで、生体分子や投与薬剤を直接検出し、生体組織上における目的化合物の分布を画像として表示する技術である。脳組織のMSイメージングにおいて、脂質の分布情報は得られているが、タンパク質の解析は進んでいない。微量のタンパク質は、組織の中にある多種類多量のタンパク質に埋もれてしまい、同定することが困難だからである。この研究は、MSイメージングにおけるタンパク質の検出の効率を上げて、より多くのタンパク質の局在情報を得るための技術開発が目的である。昨年度に引続き、組織切片上のタンパク質を、位置・形態を保ったままブロッティング膜に転写し、それを質量分析で同定する手法の改善を行っている。平成29年度は、組織切片の化学処理や転写の条件を振ることによって、特に、タンパク質の膜への転写効率と、転写における位置・形態の保持とを改善する事が出来た。 2. 意義、重要性: 従来の生物学の研究に於いては、タンパクの局在、分布情報を求める時には、個々のタンパク毎に、抗体を作成したり、標識タンパクを用意したりして、個々に調べるのが主な方法である。これは、高感度であり、確立された安定な手法であるが、一つずつしか出来ないものであった。近年では、組織に存在する分子を網羅的に同定解析する手法が開発され、それによって多くの新しい知見が得られて来ているが、その中でも、タンパクの局在情報を網羅的に同定する方法は遅れている。この研究は、このタンパクの局在情報を網羅的な同定を可能にするための、技術開発が目的である。平成29年度に、タンパク質の膜転写における位置・形態の保持を改善した事は、組織切片のタンパク質の局在情報を保持したままMSイメージングする上で、役に立つものであると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 現在までのところ、平成29年度の実施計画に従い、組織切片の処理条件の検討、膜転写条件の検討、転写膜の表面処理の検討を進めている。組織切片の処理条件の検討は、膜転写の後のタンパク質の同定効率を目安に行った。化学的処理の種類によって、タンパクの転写効率はいろいろ変化させられたが、タンパクの同定効率は、必ずしも転写量だけでは定まらなかった。転写後の膜表面の化学的性状が、その後の同定の効率に大きく影響する事が分かった。膜転写条件に関しては、電気的条件、緩衝液を振って、高速な転写を行う事によって、転写効率を上げ、同時に位置、形態情報の保全を改善する事が出来た。現在のところ、転写効率や形態情報の保全が改善したのに、同定効率が当初の想定ほどの結果には達していない。その点で、"やや遅れている"と自己評価した。
Strategy for Future Research Activity	当初の実験計画に従い、組織切片の処理条件の検討、転写条件の検討、転写膜の表面処理の検討を、前年度から継続する。現在のところ同定効率には、転写後の膜表面の化学的性状が効いているようなので、その改善を図る。具体的には、タンパク自体の化学処理の影響、共在する疎水性の脂質の影響の検討を継続する。また、通常の PVDF膜ではPVDFの導電性が低いために、また、PVDFとタンパク質との疎水的結合が強すぎるために、イオン化率が低く、質量分析をする効率・感度の面で不利であるので、表面加工によるイオン化率の向上を目指す。こうして、種々の条件で転写したタンパクでMSイメージングを行い、それぞれを比較して検討する。同定効率の改善が見られたら、種々の組織からのMSイメージングを行って、更に手法の改善を行いたい。
Causes of Carryover	(理由) 研究室内の冷凍保管庫の使用状況の推移をみて、当初に今年度に予定していた大型freezerの購入を最終年度以降に繰り越したため。 (使用計画) 計画通りに、組織切片の処理条件、転写条件、転写膜の表面処理などの検討を続ける。実験により、保管する試料の増加に応じて、予定していた冷凍保管庫を購入する予定なので、翌年度分と合わせて使用する。