2016 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mice modified with genes controlling the amplitude of circadian rhythm by CRISPR / Cas9 method
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16K15193
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
池田 正明 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (80232198)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 時計遺伝子 / 振幅 / 概日リズム / ゲノム編集 / 視交叉上核 / 周期 / うつ病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
時計遺伝子はClock, Bmal1, Per (1-3), Cry(1-2)があり、これらの転写翻訳調節機構が構成する負のフィードバックループが約２４時間のリズムを作っており、殆どすべての細胞でこのシステムが機能して、ヒトの全身で概日リズムが発現していることが知られている。約24時間のリズム発現する分子の中には転写レベルで時計遺伝子によってリズム発現制御を受けるものがあり、このような遺伝子群は、時計制御遺伝子(clock-controled genes；CCG) と呼ばれている。時計遺伝子の転写翻訳によって発振する概日リズムは、振幅が大きいほど安定な発振リズムとなり、さらに振幅の大きな時計遺伝子発現を示す細胞において、その細胞内のCCGのリズム振幅は増大するもとと予測される。気分障害には気分の日内変動や睡眠障害など概日リズムの不全を伴うことが多く、この不全は気分障害の重要な症状であるばかりでなく、病因とも関連すると考えられてきた。こうした中、時計遺伝子が発見され概日リズムの分子メカニズムが解明された現在、概日リズム中枢である視交叉上核(SCN)と行動や認知、情動など脳機能を司る領域とのネットワークについて、分子やニューロンレベルでの解析が可能となっており、気分障害の病因・病態解明のための基盤が整ってきている。最近、うつ病の死後脳研究から、時計遺伝子の発現リズムが脳のうつ病と関連があるとされている領域で低下していることが報告され、うつ病の病態に時計遺伝子のリズム発現が関連していることが示唆されている。本研究課題では、視交叉上核を構成するニューロンの時計遺伝子の機能をゲノム編集技術を使って消失させ、視交叉上核の機能と気分障害との関連を明らかにすることを目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究課題では、期間中にCRISPR/Cas9法による遺伝子改変用のgRNA(ガイドRNA)/Cas9コンストラクトの作成を行い、脳スライスで遺伝子発現抑制効果を確認し、特定のSCN出力ニューロン機能破壊動物を作出して行動等を解析して、SCN出力ニューロンの役割を明らかにすることを目指す。具体的には、コンストラクトは通常CAS9によるゲノム切断タイプと、dead-Cas9（(dCas9)とKRAB不活性化配列を融合させた発現抑制作用のあるものを準備し、標的とする遺伝子は、SCNからの出力系ニューロンに発現しているAVP, VIP, GRP, CCK, GADなどの伝達物質あるいは伝達物質合成酵素で、標的遺伝子特異的配列のgRNAを設計した後コンストラクトを完成させる計画である。現在、時計遺伝子の発現抑制が実施可能かどうかを検討するためBmal1遺伝子の発現を低下させるためのgRNAを設計し、マウスの培養細胞レベルでの標的遺伝子・タンパクの発現レベル、リズム発現を検討し、それぞれが低下することが確認することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、CRISPR/Cas9法による遺伝子改変用のgRNA(ガイドRNA)/Cas9コンストラクトの作成を行い、効果を確認する実験を行っている段階である。１遺伝子あたり１個のgRNAを作成し確認作業を行う計画でいたが、必ずしもgRNA検索プログラムで選択した配列に効果があるとは限らないため、計画を変更して３種類のgRNA配列を選択し、コンストラクトを予め複数作成する方法に変更を行い実施する方針である。また、標的遺伝子のノックダウン効果について培養細胞を使ってスクリーニングする計画であったが、標的細胞に標的とする遺伝子発現が見られないものがあり、効果のスクリーニングに十分な標的遺伝子を発現している細胞をデータベース上で探索して最適な細胞を選択する実験を追加して、最適なgRNAを選別する計画である。
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| Causes of Carryover |
本研究ではCRISPR/CAS9システムによる遺伝子編集により、視交叉上核に発現する遺伝子のノックアウトを計画し、現在標的遺伝子のgRNA配列の検索を順次行っている段階である。検索システムは一部培養細胞の購入準備を除いて構築できているが、標的遺伝子のgRNA配列のスクリーニングは完了しておらず、次の組織・個体レベルでgRNAを導入させる実験には入っていない状況である。そのため、消耗品の支出に関しては、gRNA配列のスクリーニングに関連した支出のみとたったことから、次年度使用額が生じている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2017年度は引き続きgRNA配列のスクリーニングに関連した消耗品支出と、今年度から新たに組織・個体レベルでの標的遺伝子の発現抑制実験のためのパイロットスタディーを開始し、研究の主体が組織・動物個体を利用した研究に移行することになっており、これらの実験実施のための消耗品購入に、2016年に利用を予定していた資金を利用する計画である。
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