2018 Fiscal Year Annual Research Report

Use of FALI with cDNA display single-domain antibodies for efficient functional screening of therapeutic targets

Research Project

Project/Area Number	16K15206
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	櫻井隆順天堂大学, 医学部, 教授 (70225845)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	根本直人埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60509727)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	神経科学 / プロテオーム / 組換え抗体
Outline of Annual Research Achievements	フルオレセイン標識抗体と光照射によるリアルタイム蛋白質不活性化法 (FALI) は、相互作用の場における時間分解能の高い手法である。これを効率化し、特定の細胞間相互作用に関与する細胞表面分子を同定して創薬標的探索法として確立することを目指している。cDNA display技術を単一ドメイン抗体ライブラリー(VHH)に応用してFALIを行い、細胞機能アッセイ系と一体化させるための基盤技術を確立する。昨年度、アミノ酸配列既知の単一ドメイン抗体（様）分子をモデルとして用いることにより、cDNA displayの収量増加に重要であるのは、還元条件の無細胞翻訳時の蛋白質フォールディングである可能性が示された。さらに安定した構造を持つ抗体様分子をスキャフォルドとして用いることで、高効率発現と細胞へ適用するために重要な界面活性剤フリー溶液への置換が可能となった。この条件を満たす抗体様スキャフォルドを利用して、新たにスモールスケールのライブラリーを作製し、ビオチン-アビジン結合を利用してビーズに固定化した組換えタンパク質に結合するクローン選択を行った。さらに高親和性のクローンを得るためのオフレート選択やPCRによる変異導入条件の検討を進めた。また、ペプチドタグを認識する単一ドメイン抗体をモデルとして、高効率発現のための検討を行った。 FALIと組合せハイスループット創薬標的探索法として確立するため、高親和性抗体様分子のcDNA display取得を基盤として細胞への適用を進める。