2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K15281
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa University |
|---|
Principal Investigator |
村松 正道 金沢大学, 医学系, 教授 (20359813)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | virus / cancer / genome integration / Polyomavirus |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトポリオーマウイルス(HPyV)は健常人に広く不顕性感染しており、重度免疫不全時以外は病原性を示さず、健常人には無害な常在ウイルスとされている。
本研究では、このポリオーマウイルスが本当に無害なのか、それとも癌を誘発する活性があるのか、について疑問を持って始めた研究である。発ガンプロセスには宿主ゲノムへの変異蓄積が欠かせないが、もし病原性がないとされるヒトポリオーマウイルスに発ガン活性があるとしたら、変異蓄積を見る事で発ガンプロセスを評価できると考えた。
アプローチとしては主に臨床検体と細胞株の系を用い、様々な臨床検体でウイルスのゲノム挿入を捉える挑戦を行い、細胞株は独自開発した細胞系を用いてゲノム挿入を解析する。この細胞系は無害な常時ウイルスとされるヒトポリオーマウイルスのゲノムに薬剤耐性遺伝子を置換した工夫がされており、ウイルスゲノムの存在は薬剤耐性で調べる事が可能である。また薬剤存在下で培養するとゲノム挿入が観察できるユニークな実験系である。
そこで平成２８年度は、この独自細胞系を使い、どのような時にウイルス変異およびゲノム挿入が観察されるかについて、様々な条件を検討した。その結果、ある抗ウイルス因子が発現する時にゲノム挿入や変異率が上昇することが、変異解析やサザンブロットでわかってきた。一方、臨床検体のアプローチでは、臨床検体を集める段階が律速になっており、ダメージの少ないDNA抽出に適したサンプルの入手が容易でないことが判明した。そこで主に、ヒトパピローマウイルス陽性のパラホルムアルデヒド固定検体を使い、PCRを基本としたアプローチでウイルスDNA増幅を試みた。これらのDNAを使いゲノム挿入解析の条件決定を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全ての計画が期待した結果になっている訳ではないが、実験を試みたものについては結果が出ているので概ね順調とした。否定的結果としては、準備していた臨床検体の多くがパラホルムアルデヒド固定のため、ウイルスゲノム挿入解析には難易度の高い検体である事が判明した。期待した通りの結果になったのは、細胞系のアプローチにより、とある抗ウイルス因子が、あたかもウイルスゲノム挿入が変異を押し進めている事を示唆するという予備的知見が得られた事である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
臨床検体を用いたアプローチは、引き続き、研究倫理基準をパスした検体を待ち、さらに現在DNA抽出が成功したパラフィン固定サンプルを用いてウイルスの変異解析やゲノム挿入解析を試みる。当初、High through putな配列解析を想定していたが、臨床検体のDNAの質の問題や試薬の費用の問題があり、臨床検体についてはHigh through put以外のアプローチを計画している。
一方、細胞系のアプローチでは、前年度にウイルスゲノム挿入を促進するという予備的知見で得た因子については、分子生物学を主とした多角的アプローチによりエビデンスを蓄積させる。また阻害剤等とのコンビネーションで生体内で、起こっている状況を模倣した条件も加味し、ポリオーマウイルスが宿主ゲノムに挿入される現象を解析していく。
|
| Causes of Carryover |
研究に参加する学生が増えたため、謝金で対応する予定にしていたプラスミド精製やPCRといった単純作業にかかる費用を節約する事ができた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
予想以上にハイスループット核酸解析、臨床検体の調整、培養細胞、PCRや核酸精製にかかる消耗品がかかっているので、その分の消耗品購入にあてる。
|
-
[Journal Article] APOBEC3A Associates with Human Papillomavirus Genome Integration in Oropharyngeal Cancers2017
Author(s)
Satoru Kondo, Kousho Wakae, Naohiro Wakisaka, Yosuke Nakanishi, Kazuya Ishikawa, Takeshi Komori, Makiko Moriyama-Kita, Kazuhira Endo, Shigeyuki Murono, Zhe Wang,, Kouichi Kitamura, Tomoaki Nishiyama, Katsushi Yamaguchi, Shuji Shigenobu, Masamichi Muramatsu, and Tomokazu Yoshizaki
-
Journal Title
Oncogene
Volume: 36
Pages: 1687, 1697
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
-
