2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K15315
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
松本 明郎 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (60437308)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 分子状水素 / cAMP / 交感神経受容体 / β受容体 / GPCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内に取り込まれた分子状水素（H２）が様々な病態に対して有効な作用を示すことが報告されてきたが、その作用機序は依然として明らかではない。そのため、科学的に受容可能かつ有意義な研究成果が、分子状水素の作用を科学的に捉えたとは言い難い発表の中に混在してしまっている状況である。
申請者は、マウスを用いたin vivoの研究成果からH２がβ受容体シグナルを増強する作用を有することを見出し、H２は細胞内セカンドメッセンジャーであるcAMPにより作用を伝達するとの仮説に至った。この仮説の検証を目的とした本研究課題では、H２の作用点をβ受容体シグナル経路上で見出し，H２の作用がβ受容体シグナルに特異的に作用するのか，またはcAMPを共通項として他のシグナル経路でも作用するのかを明らかにすることを目標とした。
本年度は、β受容体経路をモデルとしH２の作用点となる分子を薬理学的手法を用いて明らかにすることを目指した。内在性にβ受容体を発現しているためシグナル解析に頻用されているHEK293細胞で細胞内cAMP濃度測定系を確立した。本測定系は、１時間以上にわたって細胞内cAMP濃度の推移を連続して観察することが可能であるため、受容体刺激からcAMP濃度上昇に至るまでの経路のどこにH２が作用するのか検討することを可能にした。Isoproterenol負荷により生じるcAMP濃度上昇がH２併用により賦活化される程度を比較検討した。Forskolin, IBMX処置では影響が認められなかったことから、Adenylate CyclaseやPDEはH２の主要な作用点ではないと考えられた。また、H２による増強作用はベル型の反応曲線を示した。従来から、in vivoでのH２作用はベル型の濃度応答性を示すことが知られていたため、本実験系の反応性も同様になっていると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請段階では２年目（平成２９年度）に予定していた他のGPCR系に対するH２の効果についても、前倒しで検討を開始することが出来た。Gs経路を共通して有するカルシトニン受容体を内在性に発現するLLC－PK1細胞で細胞内cAMP濃度測定系を新たに作成した。本細胞系においてもH２をリガンドと併用することにより細胞内cAMP濃度上昇が増幅されるなど、β受容体と同様の成果が得られている。
一方、１年目（平成２８年度）の目標であった、H２併用によるβ刺激増強作用の定量化に関しては、測定結果を十分に安定して得るためには実験の技術的な改善が必要であることが明らかになり、達成することができなかった。そのため、平成２９年度も継続して実施する。
平成２９年度から実施予定であったH２の効果を動物モデルでGPCR刺激増強作用として捉える計画を前倒しして初年度から開始した。β受容体刺激による影響を モニターしやすい心臓に着目し、体表心電図の解析から内因性のカテコラミンによる刺激をH２が増強させていることを安定して捉える実験系を開発できた。平成２９年度初めから解析に用いる。
以上の状況から、一部遅れも認められるが、前倒しで進められている計画も順調に進んでいることから、概ね順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、平成２９年度はH２併用によるβ刺激増強作用の定量化が可能になるように実験系の改良、データ取得・解析方法の改善を実施する。また、マウスモデルの作成が進んだため、平成２９年度はβ受容体刺激に着目したH２の併用効果をマウス個体での反応として示すことを目標とする。
これらの成果が組み合わされ、in vivoの研究成果から導かれた仮説の詳細な検証をin vitroの培養細胞系で実施した成果を、in vivoで新たなH２の生体作用を見出すことに適用する研究サイクルが構築されることが期待される。
最終的には、科学的な論拠に基づく知識を社会へ還元することを目指し、論文発表を今年度中に終えることを目標とする。
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| Causes of Carryover |
培養細胞を用いた細胞内cAMP測定系が比較的容易に確立され、それを用いた実験も比較的少ない回数でデータを得ることができた。そのため、当初予定していたよりも少ない実験経費（消耗品費など）で予定通りの研究を実施することができた。ただし、計画書では生物発光計測機器の改修を予定していたが、実際の交付金額では必要額を満たすことができず、実施できなかった。そのため、予定外の残額が生じた。研究は大学の共通機器を使用して計測を実施した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２９年度は、培養細胞系での測定を継続するとともに、マウスモデルにおける解析を進める。当初の計画には記載していなかったが、残予算を活用することにより幾つかの遺伝子改変マウスに対する分子状水素の作用を追加で検討する。野生型で認められる効果が発現する機序を新たな観点から検討することが可能になり、より多面的なH2分子の作用を検討することができる。また、これまでの研究成果の発表にあたり、オープンアクセスジャーナルを積極的に活用するための掲載料に充当する予定である。
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[Journal Article] A Novel Diphenylthiosemicarbazide Is a Potential Insulin Secretagogue for Anti- Diabetic Agent2016
Author(s)
Kenji Sugawara, Kohei Honda, Yoshie Reien, Norihide Yokoi, Chihiro Seki, Harumi Takahashi, Kohtaro Minami, Ichiro Mori, Akio Matsumoto, Haruaki Nakaya, Susumu Seino
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 11(10)
Pages: e0164785
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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