2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of highly sensitive imaging method by use of functional single-chain antibodies that discriminate the structure of advanced glycation endproduct
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16K15321
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
森岡 弘志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (20230097)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小橋川 敬博 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (90455600)
佐藤 卓史 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (70555755)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 一本鎖抗体 / 終末糖化産物 / 機能性小型抗体 / 蛍光プローブ / クリックケミストリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生体内に局在する終末糖化産物（AGEs）修飾タンパク質を高感度でin vivoイメージングできるシステムの構築を目指して、新規機能性抗AGEscFv抗体を創製し、それらの分子を用いて糖尿病性血管合併症の発症・進展のメカニズムの解明と新たな治療戦略の開発を目的としている。
本年度は、AGE構造の一種であるGA-pyridineに特異的な一本鎖抗体AGE73scFvをもとに、ファージディスプレイ法によるスクリーニングによって、抗原親和性ならびに熱安定性が改良された変異体73MuL9scFvに関して、VH領域とVL領域をつなぐリンカー部分ならびにscFvのC末端領域にトリプトファンを受光部とするランタノイド金属イオンを錯体形成させるペプチド配列（LBPペプチド：YIDTNNDGWYEGDEL）を結合させ、ランタノイド蛍光プローブとしてテルビウムを用いたscFv分子を作製した。これらの分子は十分な抗原結合活性を有していたが、様々な条件検討を進めてみたがランタノイド蛍光を観察することはできなかった。
LBPペプチドによるscFv分子へのランタノイド蛍光導入が困難であったので、蛍光プローブ導入方法としてクリックケミストリーの利用を検討した。
アジド基とシクロオクチンを利用したクリックケミストリーによる蛍光導入を進めるため、scFv分子ならびにコントロール分子としてユビキチン（Ub）に非天然アミノ酸であるp-アジドフェニルアラニン（AzF）の導入を進めた。終止コドンの一つであるアンバーコドンを非天然アミノ酸に対応させるため、それらに対応するtRNAとアミノアシル合成酵素を用いるシステムを採用した。N末端またはC末端にAzFが導入された両組換えタンパク質の調製に成功し、現在、ユーロピウムイオンを捕捉したシクロオクチン化合物とのクリックケミストリーによる蛍光導入を進めている。
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[Journal Article] Production of Single-Chain Fv Antibodies Specific for GA-Pyridine, an Advanced Glycation End-Product (AGE), with Reduced Inter-Domain Motion2017
Author(s)
Fukuda N, Noi K, Weng LD, Kobashigawa Y, Miyazaki H, Wakeyama Y, Takaki M, Nakahara Y, Tatsuno Y, Uchida-Kamekura M, Suwa Y, Sato T, Ichikawa-Tomikawa N, Nomizu M, Fujiwara Y, Ohsaka F, Saitoh T, Maenaka K, Kumeta H, Shinya S, Kojima C, Ogura T, Morioka H
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Journal Title
Molecules
Volume: 22
Pages: 1695
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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