Development of a non-viral vector to realize hereditary intractable disease treatment using genome editing technology

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15322
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 有馬 英俊 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 教授 (50260964)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 本山 敬一 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 准教授 (50515608) ; 東 大志 熊本大学, 大学院生命科学研究部(薬), 助教 (20613409)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / 家族性アミロイドポリニューロパチー / トランスサイレチン / 非ウイルスベクター / 肝臓特異的デリバリー

Outline of Annual Research Achievements

肝臓の遺伝子疾患（難病）である家族性アミロイドポリニューロパチー（FAP）は血清タンパク質トランスサイレチン (TTR) 変異体により形成されたアミロイド線維が全身諸臓器に沈着する遺伝性疾患である。本研究では、FAP に対する新規治療法としてのゲノム編集技術の開発を目的に検討を行っている。平成 28 年度においては、次の知見を得た。（１）マーカー遺伝子として GFP 遺伝子を挿入した異型 TTR のゲノム編集を可能とする 3 種の TTR-CRISPR DNA を構築した。（２）肝実質細胞特異的非ウイルスベクターとしてのラクトシル化デンドリマー (G3) とα-シクロデキストリンとの結合体（Lac-a-CDE）を構築した。（３）TTR-CRISPR DNA 溶液と Lac-a-CDE 溶液を混合後の複合体形成を電気泳動にて確認した。（４）TTR-CRISPR DNA/Lac-a-CDE 複合体の粒子径およびζ-電位はそれぞれチャージ（N/P）比 50 において 125 nm および 18.6 mV であり、全身投与後、肝臓に移行可能な物性を示すことを明らかにした。（５）チャージ比 50 で形成された本複合体をヒト肝がん細胞である HepG2 細胞にトランスフェクション後、DNA は細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体を介して細胞内に導入され、その一部は核移行すること、また、Surveyor nuclease assay の結果から、異型 TTR 遺伝子の切断が確認された。（６）本複合体を HepG2 細胞にトランスフェクション後、チャージ比 200 まで細胞障害性を示さないことが認められた。これらの結果から、TTR-CRISPR DNA/Lac-a-CDE 複合体は培養細胞条件下、異型 TTR に対してゲノム編集が可能であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要において記したように、平成28年度の研究計画では、（１）TTR-CRISPR DNA の構築、（２）肝実質細胞特異的非ウイルスベクターとしてのラクトシル化デンドリマー (G3) とα-シクロデキストリンとの結合体（Lac-a-CDE）の構築、（３）TTR-CRISPR DNA 溶液と Lac-a-CDE 溶液を混合後の複合体形成、（４）TTR-CRISPR DNA/Lac-a-CDE 複合体の物理化学的性質、（５）本複合体を HepG2 細胞にトランスフェクション後の細胞取り込み、細胞内分布、TTR 遺伝子のゲノム編集、（６）本複合体を HepG2 細胞にトランスフェクション後の細胞障害性の検討を予定していたこと、また、TTR-CRISPR DNA/Lac-a-CDE 複合体は、培養細胞条件下、異型 TTR に対してゲノム編集が可能であることが示唆されたため、おおむね順調に進展していることと判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成 29 年度には平成 28 年度に見出した知見を踏まえて、TTR-CRISPR DNA および Lac-a-CDE を用いて in vivo 研究を実施する。FAP に関する研究では、HepG2 細胞におけるゲノム編集効果に関する検討および FAP Tg モデルマウスを用いて、TTR-CRISPR DNA の体内動態、ゲノム編集に関するオンターゲット効果およびオフターゲット効果、薬効（遺伝子発現、病態改善）および安全性に関する検討を行う。病態モデルマウスに関しては、熊本大学発生医学研究所の山村教授らによって開発されたヒト V30M TTR（世界の患者で最も多い変異）のノックイン Tg マウスを用いて検討する。 TTR-CRISPR DNA とLac-PaC との複合体を静脈内投与後の肝臓における TTR mRNA 発現を qPCR により、また血中の TTR タンパク質量を ELISA により定量する。肝臓および凝集体と思われるヒト TTR 抗体陽性反応は腸管においてのみ見られることから、TTR のアミロイド繊維形成については、腸管組織の切片を作成し、免疫組織染色により検討する。ゲノム編集については、標的臓器である肝実質細胞および標的以外の肺、肝臓、膵臓、腎臓、心臓、小腸などにおけるゲノムをサザンブロットおよびシークエンサーを用いて評価する。