2016 Fiscal Year Research-status Report

腸内細菌属の質量分析による新たな薬剤耐性遺伝子タイピングの迅速分類法に関する構築

Research Project

Project/Area Number	16K15393
Research Institution	International University of Health and Welfare
Principal Investigator	永沢善三国際医療福祉大学, 福岡保健医療学部, 教授 (80706820)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	質量分析計 / MALDI-TOF MS / ESBL産生菌 / CPE産生菌 / 薬剤耐性遺伝子 / PCR法 / LAMP法 / 医療関連感染
Outline of Annual Research Achievements	近年、薬剤耐性菌による医療関連感染では腸内細菌科細菌に属するESBL産生菌やCPE産生菌の急増が問題となっている。そこで、平成28年度はESBL産生菌（大腸菌、肺炎桿菌など）、CPE産生菌（カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌）およびnon-ESBL・CPE産生菌などの菌株収集を関連施設の協力により合計300菌株程度を収集した。収集した菌株はディスク鑑別法での表現系による分類を使用し、大きくESBL産生菌（クラブラン酸による阻害作用）、AmpC産生菌（ボロン酸による阻害作用）、CPE産生菌（CIM法）に分類した。また、ESBL産生菌・CPE産生菌については薬剤感受性試験（ペニシリン系・セフェム系・カルバペネム系など）も併せて検討を行なった。このスクリーニング的な分類作業と薬剤感受性試験の実施がH28年度の検討で大きく時間を要した。 ESBL産生菌およびCPE産生菌の確定には、PCR法、Multiplex PCR法およびLAMP法による鑑別を実施する予定である。現在、ESBL産生菌およびCPE産生菌を検出するプライマー設計を実施している。特にCPE産生菌に関しては誰も作製していないBig 5遺伝子（IMP, VIM, NDM, KPC, OXA）を検出するLAMP法のプライマーを同時に作製・検討を行い、詳細な分類ができる体制を構築する予定である。申請者はマトリックス支援レーザー脱イオン化飛行時間質量分析法（MALDI-TOF MS）での波形データを応用し、MRSA菌株間の相同性の違いを鑑別する新しい解析手法を平成25年度の挑戦的萌芽にて確立した。この技術を利用し、ESBL産生菌およびCPE産生菌の検出を遺伝子学的分類法と比較しながら薬剤耐性菌の迅速検出および分類法の確立をMALDI-TOF MSの技術で構築する事を目的としている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 菌株収集：関連施設の高木病院および九州耐性菌検査ネットワーク参加施設の協力によりESBL産生菌（大腸菌、肺炎桿菌など）、CPE産生菌（カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌）およびnon-ESBL・CPE産生菌など合計菌株：300菌株程度を収集した。なお、ESBL産生菌は比較的容易に収集できたが、CPE産生菌については収集菌株数が少ない状況であるため、H29年度もCPE産生菌については収集を予定している。ディスク法による薬剤耐性菌の鑑別：ESBL産生菌、CPE産生菌が疑われた菌株を対象に、ESBL産生菌はクラブラン酸による阻害作用の有無、CPE産生菌はメロペネム含有のディスクを使用したCarbapenemase Inactivation Method（CIM）試験にてスクリーニング分類を実施した。また、ESBL産生菌・CPE産生菌については、予定をしていなかった薬剤感受性試験（ペニシリン系・セフェム系・カルバペネム系など）を併せて実施し、H28年度に薬剤感受性パターンと薬剤耐性菌の関連性を検討するように追加企画した。薬剤耐性遺伝子による鑑別：ESBL産生菌およびCPE産生菌を確定するためPCR法、Multiplex PCR法およびLAMP法を実施する予定である。そのため、ESBL産生菌およびCPE産生菌を検出するプライマーの設計を実施している。特にCPE産生菌に関しては誰も作製していないBig 5遺伝子（IMP, VIM, NDM, KPC, OXA）を検出するLAMP法のプライマーを同時に作製・検討を行い、詳細な分類ができる準備も実施している。 MALDI-TOF MSによる波形解析：一部のESBL産生菌について、エタノール・ギ酸処理抽出法を実施し、MALDI Biotyperにてスペクトル波形を最低２回以上集積した。
Strategy for Future Research Activity	菌株収集：今後も関連施設を中心に継続してESBL産生菌およびCPE産生菌の菌株収集を継続して実施する。なお、H30年度には本研究事業に併せてバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の耐性遺伝子とMALDI-TOF MSによる波形解析を検討する可能性があるため、H29年度にVRE菌株の収集を実施する。薬剤耐性遺伝子による鑑別：ESBL産生菌およびCPE産生菌を確定するためPCR法、Multiplex PCR法およびLAMP法を実施する。現在、ESBL産生菌およびCPE産生菌を検出するPCR法でのプライマー設計およびLAMP法でのプライマー設計も目途がついたため、収集菌株については遺伝子検査を実施する。 MALDI-TOF MSによる波形解析：収集したESBL産生菌、CPE産生菌およびnon- ESBL・CPE産生菌について、エタノール・ギ酸処理抽出法を実施し、MALDI Biotyperにてスペクトル波形を最低２回以上集積する予定である。
Causes of Carryover	H28年度購入予定のPCR装置およびゲル撮影装置は、関連施設のPCR装置一式を無償で使用できたため、機器の購入には使用せず、プライマー作製費および検証実験の試薬費として使用した。
Expenditure Plan for Carryover Budget	CPE産生菌に関しては誰も作製していないBig 5遺伝子（IMP, VIM, NDM, KPC, OXA）を検出するLAMP法のプライマーを同時に作製・検討を予定しているため、このLAMP法開発費用しとて使用する予定である。