Establishment of disease model organoid by CRISPR/Cas9 method and the analysis method for mutations

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K15433
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 洪 繁 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (90402578)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石黒 啓一郎 熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (30508114) ; 石黒 洋 名古屋大学, 総合保健体育科学センター, 教授 (90303651)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: cftr / ノックアウトマウス / オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

近年体性幹細胞の培養方法として、オルガノイド培養技術が開発された。オルガノイドは、採取した臓器由来の上皮構造を残したまま培養可能であり、ミニ臓器とも考えられる。本研究では、オルガノイド培養技術と最新のCRISPR/Cas9ゲノム編集技術を併用することで、嚢胞線維症(CF)の疾患モデルオルガノイドを簡便且つ、多数同時に樹立する技術を開発し、ラージスケールで変異遺伝子の機能解析、薬剤スクリーニング等に使用可能な新しい膜タンパク機能解析手法の開発を目標とした。
各組織由来オルガノイドにcftr遺伝子変異を導入するための準備として、ゲノム上に152kbpにわたって存在するcftr遺伝子全エクソン領域を除いたKOマウスのヘテロ接合体を、CRISPR/Cas9技術で作成する。このマウスでは、片アレルのcftr遺伝子が全エクソン領域で削除されているため、野生型(WT)cftrアレルを1つだけ持つ。
平成２８年度は、マウスの片アレルでcftrゲノム全長を欠くマウスを作出するための、ベクターコンストラクトの作成と、遺伝子組換えES細胞の作成を行った。その結果、４クローンの遺伝子組換えES細胞株を取得することができた。平成２９年度には、これらのクローンを使って遺伝子組換えマウス個体の作出を行ったところ、複数のキメラマウスが作出された。これらのキメラマウスから、片アレルでcftrゲノム全長を欠くヘテロ接合体の作出を試みたが、合計20以上のキメラマウスから生殖細胞系列にゲノム欠失が入らなかった。現在、ES細胞のスクリーニングを再開しており、遺伝子組換えES細胞が得られ次第、マウスの個体作出を行う予定である。