ネフリンレポーターマウスを用いた新規ポドサイト保護薬の探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15469
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 森 潔 静岡県立大学, 薬学部, 特任教授 (60343232)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松阪 泰二 東海大学, 医学部, 教授 (50317749)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 腎臓学 / ネフリン / レポーター / 糸球体 / 化合物ライブラリー

Outline of Annual Research Achievements

PITT法および古典的な顕微注入法により、nephrin-EGFP knockin miceとnephrin-mCherry transgenic miceの2系統のレポーターマウスを樹立した。nephrin-EGFP constructを遺伝子導入した段階でポドサイト特異的にEGFPが発現するはずであったが、原因不明の理由のために発現が見られなかった。そこでCAG-FLPe transgenic mouseと交配して、Neo耐性遺伝子を含むFRT間領域の除去を行い期待通りの発現を得ることができた。
野生型マウスあるいはレポーターマウスの左心室よりDynabeads M-450を灌流し、両腎摘出後にミンス、Collagenase A+DNase Iにより消化、磁気スタンドにて高純度糸球体(>95%)を単離した。糸球体培養2日目以降は生体内の5%以下にネフリン遺伝子発現が低下した。96 well plateに150-200 glomeruli/wellで糸球体をまいて、5日後にCellomics ArrayScan VTI (Thermo Scientific)にてEGFPの蛍光強度を定量した。
従来はマウスの糸球体をsieving法で単離する場合には直径45μmのメッシュを最終段階で用いていたので、ArrayScanではその大きさに相当する2000μm2より大きい細胞塊を糸球体と認識させて自動定量を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ネフリンレポーターマウスの樹立および、糸球体由来のレポーターシグナルの定量法の開発に計画通り成功した。

Strategy for Future Research Activity

ネフリンレポーター糸球体を用いた化合物ライブラリーのスクリーニングを進める。podocyteのviabilityに影響を及ぼすと考えられている1,25(OH)2 VtD3 (1-1250nM)およびall-trans retinoic acid (0.04-25μM)について、レポーターへの効果を検討する。
スクリーニング化合物は10mM in DMSOの状態で供給を受ける。ビタミンDの効果を最大化する条件検討を行い、最初3日間はDMEM培地+10% Fetal Calf Serum (FCS)、次の2日間に化合物を添加しFCSを0.5%に減らすものが良いと判断しているが、更なる至適化を行う。ビタミンDの有無に関わらず、2%DMSOの存在はレポーター活性を20%低下させたが、ビタミンDの効果を見ることには影響しなかった。一次スクリーニングでは化合物10μM+1%DMSOで48時間処理し、4% paraformaldehyde固定、300ng/ml DAPIで核染色し、ArrayScanにて糸球体の同定、EGFP蛍光強度の定量を行う。

Research Products

• [Journal Article] Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. (2017)
  • Author(s): Mori KP, Yokoi H, Kasahara M, Imamaki H, Ishii A, Kuwabara T, Koga K, Kato Y, Toda N, Ohno S, Kuwahara K, Endo T, Nakao K, Yanagita M, Mukoyama M, Mori K
  • Journal Title: J Am Soc Nephrol Volume: 28 Pages: 278-289
  • DOI: 10.1681/ASN.2015101168.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ablation of the N-type calcium channel ameliorates diabetic nephropathy with improved glycemic control and reduced blood pressure. (2016)
  • Author(s): Ohno S, Yokoi H, Mori K, Kasahara M, Kuwahara K, Fujikura J, Naito M, Kuwabara T, Imamaki H, Ishii A, Saleem M, Numata T, Mori Y, Nakao K, Yanagita M, Mukoyama M
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6 Pages: 27192
  • DOI: 10.1038/srep27192.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Lipocalin 2 prevents intestinal inflammation by enhancing phagocytic bacterial clearance in macrophages. (2016)
  • Author(s): Toyonaga T, Matsuura M, Mori K, Honzawa Y, Minami N, Yamada S, Kobayashi T, Hibi T, Nakase H
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6 Pages: 35014
  • DOI: 10.1038/srep35014.
  • Peer Reviewed