2016 Fiscal Year Research-status Report
孤発性タウオパチーに相関するタウ遺伝子多型の生化学的意義のゲノム編集を用いた解明
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16K15479
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
小野寺 理 新潟大学, 脳研究所, 教授 (20303167)
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2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | MAPT / スプライシング / CRISPR-Cas9 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノムワイド相関解析にて多くのリスク一塩基多型(SNPs)が同定された．しかし，それらのSNPsの多くは，調節領域，非翻訳領域，イントロンに存在し，生化学的意義が不明である．タウの蓄積を認める進行性核上性麻痺(PSP)，皮質基底核変性症(CBD)でも，タウ遺伝子多型との相関が知られている．しかし，これらの多型の生化学的な意義付けは，個体間の背景遺伝子、年齢，環境因子の影響があり解析が困難であった．近年開発されたCRISPR-Cas9法によるゲノム編集は，内在性の遺伝子の一塩基レベルでの編集を可能とした．本申請は，本技術にてタウ遺伝子関連のPSP/CBDリスクSNPsを変化させ，タウ遺伝子の発現量，スプライシングへの影響を明らかとする．これにより疾患関連SNPsの生化学的な意義を解明し，新規治療のターゲットを創出するゲノム編集にはCRISPR-Cas9法を用いる．本年度は、CRISPR / Cas9系を用いて効率的に変異を導入する方法として開発されたCORRECT法について検討した（Paquetら、Nature 2016）。 MAPT遺伝子の選択的スプライシングを改変する点変異をCORRECTを用いてMAPT遺伝子に導入し、突然変異誘発事象を、対立遺伝子特異的TaqManプローブを有するddPCRシステムまたはHiDi DNAポリメラーゼを用いるPCRシステムを用いて評価した。その結果、我々はHiDi DNAポリメラーゼを用いてddPCRまたはPCRを用いてMAPTの遺伝子編集の効率を推定することを可能とした。ゲノム編集導入率は標準的な方法で1.0％であった物を4.5％まで向上させた。しかし、効率はAPPSweまたはPSEN1M146Vについての結果と比較して依然として低く、効率は遺伝子によって著しく異なる可能性があることを明らかとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定された実験について、概ね終了しているため、
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| Strategy for Future Research Activity |
導入した細胞を単離し、そのスプライシング変化について明確とする。
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| Causes of Carryover |
本年度は、研究室で保管してた試薬により、研究を遂行することが可能であったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度において、遺伝子導入のための試薬購入、及びヌクレオチド作成、iPSの維持管理に使用する。
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