2017 Fiscal Year Research-status Report
HLA組換えマウスを用いたCD8陽性T細胞のデングウイルス防御免疫への関与検討
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16K15519
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
水上 修作 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (00508971)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | デング熱 / iPS細胞 / 樹状細胞 / 細胞性免疫 / 組換えマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デングウイルス(dengue virus, DENV)感染症は毎年2億人以上の感染者を出しながら、未だに4つある血清型すべてに十分な効果を示すワクチンは存在しない。また昨年には、実用化されたワクチンの副作用がフィリピンで報じられるなど、その道は容易ではない。
従来、ワクチンの多くは中和抗体の誘導を目指した液性免疫に着目したものが多かったが、近年はT細胞が主役となる細胞性免疫の役割に注目が集まっている。研究代表者らもその点に着目し、本研究ではHLA組換えマウスでの検討を最終的なゴールとして、まずはiPS細胞由来樹状細胞株(iPS-ML-DC)を用いたin vitroでのDENV特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導から実験を開始した。平成28年度には、iPS-ML-DCがDENVの宿主となること、またDENV感染iPS-ML-DCがナイーブT細胞を活性化することを確認していた。
平成29年度は、上記T細胞活性化実験を、DENV感染/非感染iPS-ML-DC、HLAがiPS-ML-DCとmatchしている/いないナイーブT細胞を用いて行い、その結果の比較から、これまでに見られていたT細胞活性化が抗原特異的であることを確認した。また、これらの実験結果をまとめ科学誌に投稿した。修正依頼を受け、現在追加実験を行っており、近日中のアクセプト・掲載が期待される。
今年度はHLA-A24組換えマウスを購入し、TypeIIFNを抗体により除去しDENV感染実験の予備実験を行う予定であった。しかし、研究内容をKeystone Symposiaで発表した際に、利用可能と考えられるこの方法以外のいくつかの実験系の情報を得た。このため、最終的に、TypeIIFN受容体のCRISPR-Cas9法を用いたノックダウンを抗体投与の代わりにすることとし、組換えマウス作製は次年度に持ち越すこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
In vitroでのDENV特異的CTL誘導系については平成28年度に行っていた実験を進め、CD8陽性及びCD4陽性T細胞の両者について抗原特異的にT細胞の活性化を誘導できることを確認した。
今年度はHLA-A24マウスを用いたDENV感染実験マウスモデルの実験系準備を行う予定であった。DENV関連の実験をマウスで行う際には、TypeIIFNのシグナルを除かなくてはならない。上記概要にも述べたようにマウスモデルに使用するTypeIIFNシグナルの除去方法を変更したため、当初予定していたマウス購入及び実験系整備は行わなかった。
当初はTypeIIFNに対する抗体投与を用いる予定であったが、Keystone Symposiaでの発表を行った際に、参加者からこの実験系は長期観察に耐えうるのか？、抗体投与の間接的な影響が出ることが無いのか？といった質問を受けた。また、抗体投与以外の方法によるTypeIIFNシグナルの除去もより簡便に出来るようになってきていることも分かった。最終的に、骨髄移植モデルなどと比較検討した結果、CRISPR-Cas9法を用いてHLA-A24を持つTypeIIFN受容体ノックアウトマウスを作成し、本研究に用いることとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記【現在までの進捗状況】で述べたように、当初案からマウスモデルに使用するTypeIIFNのシグナル除去方法を変更した。当初案ではHLA-A24組換えマウスからTypeIIFNを抗体で除去する予定であったが、変更案ではHLA-A24組換えマウスからCRISPR-Cas9法を用いてTypeIIFN受容体を除去することとした。本年度中にマウスの作製並びに、これを用いた実験を急ぐ予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度はHLA-A24マウスを用いたDENV感染実験マウスモデルの実験系準備を行う予定であった。マウスモデルに使用するTypeIIFNシグナルの除去方法を変更したため、当初予定していたマウス購入及び実験系整備は行わなかった。
最終的に、CRISPR-Cas9法を用いてTypeIIFN受容体ノックアウトマウスを作成し、本研究に用いることとした。
ノックアウトマウス作製には当初予定していたマウス・抗体購入よりも費用が必要になる。平成30年度は、このマウス作製及びこれを用いた実験に、繰り越した平成29年度請求分助成金と平成30年度分として請求した助成金を合わせて使用する予定である。
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