Development and applications of allosteric reverse transcriptase inhibitors for Genome engineering

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K15521
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 中村 朋文 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 研究員 (00772526)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: CRISPR-Cas9 / 蛍光蛋白質 / 逆転写酵素阻害剤 / NHEJ経路

Outline of Annual Research Achievements

我々は、CRISPR-Cas9 のHIV-1ゲノム編集を促進する薬剤の選定および同定を行い、同時にそのゲノム編集促進機序の解明を行うことを目的とした。
まずHIV由来の発現様式で非増殖性タイプの蛍光物質を搭載したベクターおよびSaCas9発現ベクター、sgRNA（HIV標的配列を含む）を作成および設定した。細胞内における蛍光蛋白発現とゲノム編集効果の評価に関して、293T細胞に作成したベクターを遺伝子移入し、蛍光物質の発現をFCM、マイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡を用いて確認およびその輝度を測定した。加えてSaCas9およびsgRNA(HIV標的配列）を細胞内に導入し、蛍光物質の輝度を測定することによってSaCas9によるHIVに対するゲノム編集効率を評価した。またsgRNAに関して複数の配列を設定し、その編集効率を評価した。結果として、SaCaS9によって標的HIVの配列が明らかに切断され、それと同時に有意な蛍光輝度の低下を認めた。またその蛍光輝度の低下は、SaCa9の発現量に依存的であることが示唆された。その他、オフターゲット効果は次世代シークエンサーを用いることによって評価する方法を試みた。また、逆転写酵素阻害剤のゲノム促進効果に関して、2015年に逆転写酵素阻害剤であるAZTがNHEJ経路を促進したと報告された。我々の方法も同様にAZT投与により蛍光輝度がさらに低下することが予想された。しかしながら我々の方法では、蛍光の低下は軽微であり有意差を認めなかった。その他、NHEJ阻害剤、HDR促進剤と報告された薬剤に関しても同様の方法で評価したが、いずれも軽微な変化であり有意な変化は認めなかった。原因として、細胞の違い（がん細胞由来のcell lineは薬剤の効果が低い）が関係している可能性がある為、新たに幹細胞系の細胞を用いる方法を試みている。