2017 Fiscal Year Research-status Report
蛍光・発光蛋白質会合センサーを用いたNLRP3インフラマソーム活性化機構の解明
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16K15527
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
平家 俊男 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (90190173)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八角 高裕 京都大学, 医学研究科, 講師 (00511891)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 自己炎症性疾患 / インフラマソーム / 蛋白質会合蛍光センサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NLRP3インフラマソームによる炎症性サイトカインの産生機構を解明することを目的として、インフラマソーム構成分子の会合と複合体形成の過程を単一細胞レベルで時間的・空間的に評価可能とする系の構築を行っている。
昨年度の時点で、目的とするタンパク質の会合を評価するシステムとして、NanoBiT Protein:Protein Interaction Systemを用い、NLRP3インフラマソームの構成分子であるNLRP3/ASC/CASP1の３つのタンパク質それぞれのN末端、C末端に発光物質を融合した12種類（発光タンパク質の断片としてNanoLuc1とNanoLuc2の2種類があり、それぞれを3つのタンパク質のN末端、C末端に融合）のコンストラクトを作成していた。しかし、これら12種類のスプリット型発光タンパク質と融合タンパク質の組み合わせの内、最終的なBioluminescence resonance energy transfer (BRET)の検出に最適であるものを選定する時点で困難が生じた。この問題点を克服する目的で、H29年度は試験管内無細胞転写翻訳系を利用したスクリーニング系を構築した。今後、最も効率的な発光を生じるコンストラクトの組み合わせを選定して正常及びCAPS患者由来疾患特異的iPS細胞へのセンサー分子の導入を行うと共に、NLRP3変異陽性及び変異陰性iPS細胞株より単球・マクロファージ系の細胞を分化させ、様々な条件下で培養して、NLRP3インフラマソーム構成分子の会合とcaspase 1の活性化につき個々の細胞レベルで時間的・空間的に評価する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Ａ）CAPS疾患特異的iPS細胞株へのセンサー分子の導入
目的とするNLRP3インフラマソーム構成分子の会合を評価するシステムとして、NanoBiT Protein:Protein Interaction Systemを用い、NLRP3/ASC/CASP1の３つのタンパク質それぞれのN末端、C末端に発光タンパク質を融合した12種類（発光タンパク質の断片としてNanoLuc1とNanoLuc2の2種類があり、それぞれを3つのタンパク質のN末端、C末端に融合）のコンストラクト、及びNLRP3/ASC/CASP1それぞれの蛍光標識HaloTag融合タンパク質作成済みである。加えて、上記のコンストラクト・融合蛋白の組み合わせから、最も効率的な発光を生じるコンストラクトの組み合わせを選定する目的で試験管内無細胞転写翻訳系を利用したスクリーニング系を構築した。
Ｂ）センサー導入iPS細胞からの単球・マクロファージの分化
センサー分子を導入したiPS 細胞が完成していないため具体的な実験は行えていないが、iPS細胞から単球・マクロファージ系細胞への分化系は確立しており、CAPS疾患特異的iPS細胞より分化した細胞を用いたin vitroでのIL-1β過剰産生が再現されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ａ）CAPS疾患特異的iPS細胞株へのセンサー分子の導入
NanoLuc1とNanoLuc2を融合させたコンストラクトを試験管内無細胞転写翻訳スクリーニング系に発現させ、更に蛍光標識HaloTag融合された3番目のタンパク質を導入して、最も強いシグナルを出す組み合わせを選定し、NLRP3インフラマソームを構成する3分子の会合過程を効率よく評価可能な組み合わせを決定する。その後、NLRP3遺伝子変異の体細胞モザイシズムを原因とするCAPS患者由来iPS細胞を用い、変異陽性及び陰性細胞に上記のセンサー分子を導入してインフラマソーム分子の会合と活性化の評価実験を行う予定である。
Ｂ）正常及び変異NLRP3インフラマソーム活性化機構の評価と解明
各種センサーを導入したNLRP3変異陽性及び変異陰性iPS細胞株より単球・マクロファージ系の細胞を分化させ、様々な条件下で培養して、NLRP3インフラマソーム構成分子の会合とcaspase 1の活性化につき個々の細胞レベルで時間的・空間的に評価する。
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| Causes of Carryover |
CAPS疾患特異的iPS細胞株へのセンサー分子の導入が遅れており、必要な試薬の購入費が残っているが、H30年度にはセンサー分子の導入の遅れを取り戻し、NLRP3インフラマソーム活性化機構の解明が進む予定である。
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