2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidating the mechanism of NLRP3 inflammasome activation using fluorescence and light emission protein-interaction sensors
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16K15527
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
平家 俊男 京都大学, 医学研究科, 名誉教授 (90190173)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八角 高裕 京都大学, 医学研究科, 講師 (00511891)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インフラマソーム / 自己炎症性疾患 / 蛋白質会合蛍光センサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、NLRP3インフラマソーム構成分子の会合と複合体形成の過程を単一細胞レベルで時間的・空間的に解析する系を構築し、炎症性サイトカイン産生機構の解明を行う事を目的として、NLRP3インフラマソーム構成分子の会合を評価するシステムの構築を進めた。
目的とするタンパク質の会合を評価するシステムとして、NLRP3インフラマソームの構成分子であるNLRP3/ASC/CASP1の３つのタンパク質それぞれのN末端、C末端に発光物質を融合した12種類（発光タンパク質の断片としてNanoLuc1とNanoLuc2の2種類があり、それぞれを3つのタンパク質のN末端、C末端に融合）のコンストラクトを作成し、これら12種類のスプリット型発光タンパク質と融合タンパク質の組み合わせの内、最終的な蛋白会合の検出に最適であるものを選定した。
続いてiPS細胞への複数遺伝子の同時形質転換を行う目的で、それぞれの遺伝子を決まったコピー数だけiPS細胞に導入でき、かつそれを安定的に保持できる系の構築を模索した。その結果、人工染色体と組換え反応を用いた遺伝子発現系を利用する事が解決策となる目処が立った。
今後は、iPS細胞へのセンサー分子導入を進展させ、センサー導入iPS細胞より単球・マクロファージ系の細胞を分化させ、NLRP3インフラマソーム構成分子の会合とcaspase 1の活性化につき個々の細胞レベルで時間的・空間的に評価する予定である。
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