ミトコンドリア内非コードRNAを病因とするミトコンドリア病の新規発症メカニズム

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15531
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 岡崎 康司 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (80280733)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水野 洋介 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30406532)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ミトコンドリア内RNA / 非コードRNA / マイクロRNA / ミトコンドリア病

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度の研究内容として、まずはヒト培養細胞からのミトコンドリア内に存在する全RNAをインタクトな状態で採取する実験系の確立を行った。酵素活性能をなるべく維持した状態でミトコンドリア画分を採取することが、より安定的にミトコンドリア内に本来存在するRNAの取得につながると考え、従来の密度勾配遠心法に加えて複数の細胞内ミトコンドリア画分採取プロトコルを検討した。
得られたミトコンドリア画分についてRNAの収量や分解度合い、ミトコンドリアRNAの濃縮度合いを測定して、最良と考えられる分画法を決定した。そのプロトコルに基づいて、当該年度は特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞と、さらに別の複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞を用意し、ミトコンドリア画分を抽出した。
得られたミトコンドリアRNAについて、次世代シーケンサーを用いた発現RNA解析に先立ち、既知のmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAの発現変動を発現アレイを用いて検索した。
その結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAを多く捉えることが出来た。この中に、ミトコンドリア機能を制御したり影響を及ぼし、ひいてはミトコンドリア病の発症要因にもなるRNAが含まれていると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ミトコンドリア機能を制御したり影響を与えるRNAを効率よく探索するために、平成28年度は複数のミトコンドリア関連遺伝子をノックアウトもしくはノックダウンさせた細胞を準備するとともに、インタクトなRNAを含むミトコンドリアを高効率に取得する実験系の確立に注力した。このため、平成28年度中には次世代シーケンサーを用いた発現解析を実行するまでには至らなかったが、その解析を行うための細胞を多種類用意できた他、次世代シーケンサーに先立ち各種発現アレイ解析を行い、ミトコンドリア関連遺伝子の発現変動の影響を受けて発現量が変化したRNAを複数種類検出することが出来たため、次年度以降にその検証実験を行うことが可能となった。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度中に得られたサンプル細胞のミトコンドリア画分RNAを用いて次世代シーケンサーによる発現解析を行い、ミトコンドリア関連遺伝子の発現変動の影響を受けて発現量が変化したRNAについて、より詳細に探索を行っていく予定である。また、それらのRNAがミトコンドリア機能に影響を及ぼす動作メカニズムを明らかにするための実験を行う予定である。

Causes of Carryover

平成28年度は複数の細胞サンプルの採取とインタクトなRNAを含むミトコンドリア画分の採取に注力したため、次世代シーケンサー解析を実施しなかった。このために、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度までに得られた細胞サンプルと、平成29年度に新たに得られる細胞サンプルを用いて、平成29年度に次世代シーケンサー解析を行う。