2017 Fiscal Year Research-status Report
神経発達障害のシナプス病態解明 -シグナル伝達経路異常の網羅的・定量的解析-
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16K15554
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
染矢 俊幸 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50187902)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 神経発達障害 / GAP43 / NLGN3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
成長円錐のリン酸化プロテオミクスにより同定された神経発達に重要なタンパクリン酸化部位のうち、統合失調症および自閉スペクトラム症（Autism Spectrum Disorder; ASD）のリスク遺伝子であるGAP-43遺伝子、NLGN3遺伝子を選定して機能解析を進めている。GAP-43機能に最も重要と予測されるリン酸化部位であるSer41部位の変異（Ser41Ala）のヘテロノックインマウスを作成、それらのマウスを交配させホモノックインマウスを作成し、その全脳ホモジネートを作成した。GAP43野生型のマウスについても全能ホモジネートを作成し、抗GAP43リン酸化部位（pS41）抗体もしくは抗GAP43抗体を用いてイムノブロッティングによるタンパク定量を行った。その結果、GAP43自体の量に有意差はなかったが、pS41のリン酸化量はホモノックインマウスで消失していた。今後は同ノックインマウスの初代神経細胞培養を行い、免疫組織学的にGAP43_Ser41リン酸化タンパクの分布について確認する予定である。ヒトASD患者において同定され、in silico解析により遺伝子機能に強い影響を与えていると予測されたGAP43遺伝子のAsp23Gly変異のプラスミドベクターを作成した。この変異をHela細胞にリポフェクション法を用いて導入し、抗GAP43抗体を用いて免疫組織学的に観察したところ野生型GAP43を導入した細胞と比較して、GAP43の細胞膜への分布が減少しているという予備的な結果を得た。成体マウス4体からそれぞれ別に全脳ホモジネートとシナプトソームを作成し、NLGN3遺伝子のリン酸化部位の抗体（pS745抗体）でイムノブロッティングを行ったところ、ホモジネートと比較してシナプトソームに強い集積が確認された。さらにラットの培養神経細胞をpS745抗体で免疫染色したところ、軸索先端が強く染色され、このリン酸化が軸索先端およびシナプスの両方で強く発現していることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
GAP43遺伝子のSer41部位の変異（Ser41Ala）のヘテロノックインマウス同士の交配によりホモノックインマウスがなかなか生まれなかったこと、同遺伝子のAsp23Gly変異のプラスミドベクターの作成に予定よりも時間を要したことなどから予定通りの期間内に研究計画を実行することができなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
GAP43遺伝子のAsp23Gly変異を株化細胞および初代培養神経細胞に導入し、機能解析を行い重大な機能的変化を同定した場合、同変異のノックインマウスの作成を開始する。NLGN3遺伝子のリン酸化部位S745の変異を導入するためのプラスミドベクターを作成し、同様に包括的な機能解析を行っていく。
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| Causes of Carryover |
【現在までの進捗状況】に記載した理由により計画通りに実験を巣こうすることができなかった。GAP43およびNLGN3遺伝子のリン酸化部位の機能解析を進めるために、発現ベクターの作成や抗体などに使用する予定である。
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