2016 Fiscal Year Research-status Report
マイクロビームを用いた細胞核・細胞質照射における防御細胞応答の解析
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16K15586
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| Research Institution | National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology |
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Principal Investigator |
小西 輝昭 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 放射線障害治療研究部, 主任研究員(定常) (70443067)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マイクロビーム / 陽子線 / 細胞質 / DNA二本鎖切断 / DNA修復 / g-H2AX / Nrf2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本題の目的は、陽子線マイクロビームを活用し、細胞核のみに照射した細胞と比較して、細胞質にのみ、さらには、細胞核・細胞質の両方に照射細胞のDNA二本鎖切断（DSB）修復ならびに、酸化ストレス応答経路の活性化に着目して解析することで、細胞質内ダメージのDSB修復機構への影響を評価することである。平成２８年度において、①細胞核のみ、②細胞質のみ、③核と質の両方の３条件を設定し、陽子線をヒト肺正常WI-38細胞に照射し、照射の1、4、8、16、24時間後にヒストンタンパク質H2AXのリン酸化（γ-H2AX）に対して免疫蛍光染色を行った。細胞蛍光画像より細胞核当たりのγ-H2AX量を算出し、その生成・消失について解析を行った。
その結果、① 細胞核への照射では、照射１時間後で γ-H2AX量はほぼ比例的に増加し、その後24時間にかけて非照射細胞と同等のレベルまで減少した。②細胞質照射では、照射４時間後のγ-H2AX量は照射粒子数依存的であった。③細胞核・質両方照射では、細胞核と細胞質とも陽子線を５００個照射し、細胞核のみに照射した場合と比較すると、両方照射の方が４時間後において若干高い値を示し、その後16時間後、24時間後において若干低い値を示した。これらの結果より、細胞質照射によってもDSBが誘発されるが、細胞質内ダメージがトリガーとなり、DSB修復を促進すると考えられた。
細胞質照射による酸化ストレス応答タンパク質の挙動を解析するために、Nrf2-Keap1経路に着目し、細胞質照射によってNrf2転写因子の細胞核移行について検討を開始した。細胞核のみ、および細胞質のみに500個の陽子線照射し、Nrf2タンパク質の核への移行を確認した。つまり、非DNA損傷を起因としてNrf2-Keap1経路が活性化することを突き止めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
放医研マイクロビーム細胞照射装置SPICEを利用するにあたって、ほぼ要望したビームタイム数を配分していただいた。よって、平成２８年度実験計画として提案したマイクロビーム照射実験の以下①－③を実施することができた。① ヒト正常肺細胞WI38の細胞「核」照射によるγH2AX量の照射粒子数依存性と照射後時間の経時変化を測定した。細胞核当たり100個、250個、500個の陽子線を照射し、照射後1，4，8，16，24時間後のγH2AX量の結果を得た。次に② 細胞「質」照射によるγH2AX量の照射粒子数依存性と照射後時間の経時変化を測定した。細胞「質」当たり100個、250個、500個の陽子線を照射し、照射後1，4，8，16，24時間後のγH2AX量の結果を得た。そして、③ 細胞「核」と細胞「質」の両方照射によるγH2AX量の照射粒子数依存性と照射後時間の経時変化を測定した。細胞「核」当たり250個、500個に対して、さらに細胞「質」に200個、500個の陽子線を照射し、照射後1，4，8，16，24時間後のγH2AX量の結果を得た。再現性を確認するため、追加実験を実施する必要がある。
細胞質照射による酸化ストレス防御応答タンパク質の挙動を解析するために、Nrf2-Keap1経路に着目し、質照射によってNrf2転写因子の細胞核移行することを確認した。線量依存性およびγH2AX量との相関についての解析は今後の課題である。また、ヒト肺がんA549細胞を用いて、Nrf2ノックダウン株の作成を開始し、10個程度のクローンを採取したが、安定株の樹立にはまだ至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞核・細胞質両方照射によるγH2AX量の測定について、①細胞核、または、②細胞質のそれぞれに照射する粒子数の条件がある。今後は、① 500個以外に、100個、250個についても実験計画に追加する。また②についても、同様であり、細胞質ダメージ量を変化させて検討する必要がある。現在、200個、500個の2点のみであるが、より照射粒子数の範囲を拡大し、細胞質あたりの照射粒子数100個、1000個も検討する。
次に、細胞質照射による酸化ストレス応答タンパク質の挙動を解析するために、Nrf2-Keap1経路に着目し、細胞質照射によってNrf2転写因子の細胞核移行について細胞核のみ、および細胞質のみに500個の陽子線照射において、照射16時間後にNrf2タンパク質の核への移行を確認した。今後は、線量依存性についても検討する。
また、Nrf2－Keap1経路をtBHQなどのNrf2誘導剤を用いて、照射の事前に活性化させ、そのDSB修復速度を測定することで、Nrf2－Keap1経路の活性化がDSB修復に関係しているのかを確認する。また、p53タンパク質やDSB修復タンパク質であるXRCC4の発現量の増加についても解析をすすめていく。
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