固形がんの末梢循環癌細胞を標的とした遺伝子改変T細胞移入療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K15602
• Research Institution: Kanagawa Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 和田 聡 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), がんワクチンセンター, 医長 (30420102)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 矢田 英理香 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, 特別研究員 (30415567)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: CTC / PDX / 次世代シーケンサー / 膵臓がん / 胆管がん

Outline of Annual Research Achievements

患者サンプルを用いたCTC解析ではこれまでに5名の患者において施行し、血中循環癌細胞濃縮回収装置（Clear Cell FX）のダブルランにてそれなりの細胞数を得る事ができた（治療前：13-235個/1sample、4-78個/1ml、治療後：65-305個/1sample、21-93個/1ml）。しかしながら、がん細胞である事を証明するための免疫染色実験において、EMTマーカー又はMETマーカー陽性(CTC)とCD45陽性(造血系細胞)とのダブルポジティブ細胞を多数認めるため、TAMとの鑑別を行いながら再度条件検討を行っている。PDXモデルでは、まずマウス血液と人がん細胞(MiaPaCa細胞)とを混合したサンプルを用いてClear Cell FXの条件検討を施行した。次に膵がんPDX及び胆管がんPDXを用いたCTC解析では、腫瘍組織移植後tumor volumeが1500mm3に達した時点で末梢血採血を行った。Clear Cell FX にてダブルラン施行後、CTC細胞（EGFP(-), mouse MHC(-), HLA(+)）を同定する事に成功した。しかしながら、肝心のPDXモデルにおいて転移巣を確認できないため（PDX10系統において施行）、皮下移植モデルから同所移殖モデルに変更して転移巣の確認を現在行っている。予備的実験として、膵がんCell lineであるMiaPaCa2細胞を移植したCDXモデルを用いた実験を行い、このモデルでは肺転移及び肝転移を認める事を確認した。現在このモデルを用いてCTC細胞の回収を行っている。今後は、PDXモデルとCDXモデルとを並行して実験を行い、CTC細胞と原発巣及び転移巣からDNA/RNAを抽出し次世代シーケンサー解析（NGS）を施行する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

患者サンプルの採取は予定通り行われており、血中循環癌細胞濃縮回収装置（Clear Cell FX）を使用した細胞の回収も良好に施行できている。しかしながら、がん細胞であることを証明するための免疫染色実験の条件検討に当初の予定よりも時間が掛かっている。予備実験では比較的きれいに染色できるが実際のサンプルを用いると概要で記したような問題が起こる。
PDXモデルを用いたCTC解析では、これまでに行われたことがほとんどない実験であるため、予備実験で時間が掛かるかと思われたが比較的容易に条件検討を終えることができた。しかし、当初認められたPDXの転移巣が、PDX10系統用いてがんがかなり進行した時点においても転移巣が認められないハプニングが起こった。転移巣が認められなければ回収したCTCが予後に寄与するとは考えづらいためこの状況では前に進められない。

Strategy for Future Research Activity

再度健常人の血液を用いた条件検討を行い、患者サンプルを用いた実験ではTAM因子も付け加えて除外解析も行う。条件をクリア出来ればCTCからDNA/RNAを回収し次世代シーケンサー解析を行い、転移巣からのデータと合わせて比較解析を行う。マウスモデルではPDXモデルとCDXモデルとを同時に進行し、同所移殖PDXモデルで転移巣を認めなければCDXモデルにて研究を継続する。

Causes of Carryover

患者サンプル及びPDXモデル共にCTC採取に時間が掛かっており、当該年度に施行する予定であった次世代シーケンサー解析を施行できなかったため、次年度への使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

計画進行がやや遅れているが、CTC採取後予定通り次世代シーケンサー解析を行う。転移巣との比較解析を行い共通因子を同定できれば免疫実験へと移行する。