direct conversion of mouse fibroblasts into cochlear hair cells by the defined transcription factors

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K15719
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 伊木 健浩 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (20755649)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: otosphere / 蝸牛有毛細胞 / 転写因子

Outline of Annual Research Achievements

○tet-onマウス蝸牛のotosphere作成：iPS干渉法ではotosphereに転写因子とSox2、Oct3/4、Klf4、c-Mycの初期化４因子を導入する。この際、導入効率のばらつきを最小限にするため、初期化4因子をendogeneousに発現するdoxycycline（Dox）投与によるtet-on発現マウスを用いる。H28のICRマウスでのプロトコールに従ったところ、得られたotosphereは１回の継代をはさみ８日間の維持培養が可能であった。
○otosphereからiPS細胞樹立：所属研究室にて既に確立していたDoxマウスのMEF（マウス胎仔繊線維芽細胞）からのiPS細胞樹立プロトコールをもとに検討を進めた。MEF由来では2週間でコロニー形成が確認されたが、Otosphere由来では1ヶ月以上を要した。得られたコロニーにつき、幹細胞マーカー（SSEA-1、ALP）で染色した結果、強陽性コロニーは5-10％であった。そこでiPS細胞樹立を促進する目的で、様々な誘導剤の併用を試みたが、顕著な効果は見られなかった。
○昨年度の研究成果「Otosphereのマイクロアレイ解析による内耳幹・前駆細胞の維持に関わる転写因子の同定（Iki T, et al., PLOS One）」から、蝸牛感覚上皮に比べotosphereで有意な発現上昇を認めた遺伝子の中からCD14に注目し、検討を進めた。まず、qPCRならびにフローサイトメトリーにより、otosphereでの発現上昇を再確認した。また免疫染色像では、マウス蝸牛感覚上皮において、CD31陽性血管内皮細胞やIba1陽性マクロファージ細胞とは独立して局在するCD14陽性細胞が確認された。