2017 Fiscal Year Research-status Report
加齢黄斑変性の新規病因遺伝子探索をもとにした戦略的治療開発
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16K15733
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
馬場 高志 鳥取大学, 医学部附属病院, 講師 (40304216)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 幸次 鳥取大学, 医学部, 教授 (10213183)
宮崎 大 鳥取大学, 医学部附属病院, 講師 (30346358)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 加齢黄斑変性 / 疾患モデルマウス / 血管新生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
候補因子Xの血管形成メカニズムの解析（In vitro）：野生型と因子Xまたは，因子X受容体欠損マウス，因子Xと結合する別の受容体欠損マウスの骨髄由来血管内皮細胞を用いて，候補因子Xとその関連する因子の刺激によるVEGFR-1（FLT1）とMCP-1（CCL2）の発現をRT-PCRとELISA法を用いて検討した。また，同じマウスを用いて血管内皮細胞チューブ形成アッセイで管腔形成の感受性を確認し，因子Xとその受容体のシグナルによってVEGFR-1とMCP-1が誘導され，血管形成が促進されることが裏付けられた。更に，骨髄由来細胞だけでなく，野生型マウスとヒトの初代網膜血管内皮細胞をそれぞれ用いて管腔形成を確認したところ，骨髄由来細胞で得られた結果を裏付けることができた。
因子Xのマウス骨髄細胞移植加齢黄斑変性（AMD）モデルを用いた機能解析：低毒性生細胞蛍光標識法でラベルしたマウス骨髄細胞を移植したAMDモデルマウスを作成し，脈絡膜新生血管（CNV）の解析を行った。CNVに集簇した因子X陽性細胞の動態を解析するため，各種血球系マーカーを用いた多重染色で，CNVの感受性に関与した因子X陽性の骨髄由来細胞の分化とCNVへの集簇を確認した。この細胞は， CNVの成熟に伴い空間的に集簇する場所が変化しており，因子Xの時間的な発現変化と関係がある可能性がある。
AMD患者と健常者より得られた検体のSNP解析：同意が得られたAMD患者と健常者より提供された血液検体から得られたゲノム情報をもとに,既知の加齢黄斑変性関連遺伝子とともに因子Xのプロモーター領域に存在するアリルについてAMDの疾患感受性との相関を確認した。ゲノム情報解析と同時に進めている前房水検体のプロテオミクス解析から，AMDの病型によって因子Xの関与が異なる可能性があり，検体数の不足を補うため，引き続き解析を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1．候補因子Xのマウス骨髄由来細胞と網膜血管内皮細胞を用いた作用解析（in vitro）：概ね順調であるため，今後，引き続き検討を行う。
2．候補因子XのCNVにおける作用の時系列解析（in vivo）：実験に必要な因子X関連遺伝子欠損マウスは妊孕性が極めて低いため，十分な個体数確保と維持のためには体外受精を用いる必要があり，遺伝子欠損マウスの増産が困難である。現在，遺伝子欠損マウスの骨髄移植細胞を用いた系の再現性を確認するためのマウスを準備中である。
３．AMD患者と健常者より得られた検体のSNP解析：加齢黄斑変性患者と健常者から得られた検体数を更に増やす必要があり，今後，検体のボリュームや他の候補について解析するなどスケールを拡大する前に，現在，得られた結果について，AMDの病型毎の分類も含め，見直しを行う必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
1．候補因子X受容体下流シグナルのCNV形成への関与の解明：因子X受容体刺激下の骨髄由来血管内皮細胞で発現した分子の網羅的解析の結果をもとに，因子X受容体下流の血管形成メカニズムについて探索を進める。GFPマウス骨髄を移植したAMDモデルマウスの，レーザー照射後の時系列でのGFP標識移植骨髄由来細胞のCNV内の空間的な配置について検討するとともに，各種細胞マーカーを用いて，分化した細胞の種類について免疫組織学的手法で解析を進める。
2．候補因子XのMAPKを介したシグナル伝達の検討：因子X受容体刺激後のCNV発生メカニズムについて，これまで行ってきたin vitroの解析から，MAPKを介したシグナル伝達を介している可能性が考えられた。細胞骨格構成分子の再構築を促すことにより，直接的にCNVを誘導している可能性を検討する。
３．AMD患者と健常者より得られた検体のSNP解析：AMD患者と健常者より得られた血液由来のゲノム情報をもとに，引き続き，因子Xプロモーター領域のSNP解析を行う。研究の発端となった患者由来の前房水のプロテオミクス解析の検体数を増やして更に解析を進めた結果，AMDの病型により因子Xの関与が異なる可能性が浮上した。その検証のため，病型による病態メカニズムの相異に関与するのか確認し，マウスAMDモデルの解析結果や血管内皮細胞を用いた解析結果との妥当性を検討する。少なくとも，AMD疾患感受性と何らかの相関があることは推測されるため，検体数を可能な限り増やすとともに，実臨床情報が豊富である利点を活用して，症例毎の表現型を個別に検討し，既知のAMDリスクアレル陽性の症例で，因子Xが修飾している要素がないかを検討する。
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| Causes of Carryover |
骨髄移植マウスCNVの時系列での解析のため実験のスケールをさらに拡大する必要があり，遺伝子欠損マウスの維持と骨髄細胞移植のドナーとしてGFPマウスの入手が必要である。また，CNVに集簇する分化したGFP陽性細胞の種類を確認するため，免疫組織学的解析に使用する細胞マーカーが複数必要である。血管形成に関与する候補因子X受容体下流のシグナル伝達について，血管形成への具体的な分子メカニズムを明らかにするため，まだ確認できていない複数の分子をin vitroの系を用いて確認する。
因子XとAMDの病型による疾患感受性について明らかにするため，AMD患者と健常者より得られた前房水のプロテオミクス解析の情報と血液由来のゲノム情報をもとにした因子Xとその受容体に関与するSNP解析の検体数を増やして，解析を引き続き進める必要がある。
因子Xとその受容体のAMDの病型による関与の相異が，ヒト前房水のプロテオミクス解析の情報と血液由来のゲノム情報から実証された場合，遺伝子欠損マウスAMDモデルを用いてCNVの形態と集簇した細胞の配置に差がないか検討する計画である。
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