Development of purification method of photoreceptors differentiated from ES/iPS cells focusing on mitochondria

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16K15736
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 森藤 暁 立命館大学, 薬学部, 助教 (20647234)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 本間 美和子 福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (40192538)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 網膜 / 多能性幹細胞 / 網膜分化法 / マウス

Outline of Annual Research Achievements

最終年度までに本研究により、ヒトのES/iPS細胞で報告されている網膜細胞への分化法をもとに、マウスES細胞での新規網膜分化法を開発することができた。この網膜分化法は、マウスES細胞を解離したのち、低吸着の96ウエルプレートに1ウエル当たり3000個をまいて、胚様体を形成させ、この胚様体をマトリゲルコートした培養皿に入れたのち、マトリゲルを含んだ網膜分化培地を加え培養を継続するというものである。この網膜分化法は、ES維持培地に未分化状態を保つためLIFのみを添加したマウスES株であるEB5株やその亜株であるRx-GFP株では、比較的効率よく網膜細胞に分化させることができたが、未分化維持が2i+LIF法でなされていたマウスES/iPS細胞では、ほとんど網膜細胞に分化させることができなかった。最終年度には、本研究による分化法を利用するため、EB5株を用いて視細胞や視細胞のミトコンドリアを蛍光ラベルできるようなノックイン細胞を作出するための、CRISPR/Cas9を利用したノックイン用ベクターの構築を中心に実施したが、CRISPR/Cas9用のベクターとノックインベクターの基本ベクターの構築までで研究期間を終了してしまい、ノックインベクターの構築には至らなかった。以上から、本研究でマウスES細胞株を用いた新規網膜分化法を開発することはできたものの、本研究の当初の目的であった、多能性幹細胞からの網膜分化により、視細胞にミトコンドリアが多いことを利用して、視細胞を濃縮する方法の開発という当初の課題については遂行することができなかった。