2016 Fiscal Year Research-status Report
肝芽腫局所進展に関わるドライバーエピゲノム変異の解明
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16K15740
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
砂原 正男 北海道大学, 医学研究科, 客員研究員 (80750314)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本多 昌平 北海道大学, 大学病院, 助教 (90588089)
宮城 久之 北海道大学, 医学研究科, 特任助教 (50596442)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 小児がん / エピジェネティクス / 肝芽腫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肝芽腫は胎児肝の発生過程における epigenetic 異常が発癌および進展に大きく関わっている。 主要血管への浸潤のため肝切除の対象とならずに一期的肝移植術をおこなった肝芽腫症例から、 ①正常肝、②原発巣のうち viable な箇所、③血管浸潤部より microdissection によって個別に抽 出した核酸を用いて、DNA メチル化プロファイル、ヒストンコード、および microRNA・mRNA 発現 プロファイルをゲノムワイドに解析する。DNA メチル化異常およびヒストン修飾異常そして microRNA 発現から肝芽腫における局所進展にはたらく epigenetic 異常を解明し、肝芽腫の新規 分子生物学的マーカーを確立し、成長発達そして妊孕性を考慮するべき小児の肝芽腫症例に対し て過不足のない個別化治療を開発することを目的とする
平成28年の計画に基づき，肝芽腫4症例の切除検体（パラフィン包埋切片）より正常肝・胎芽型腫瘍部・胎児型腫瘍部それぞれに対してDNA・RNAを分別抽出した（12サンプル）。網羅的メチル化ビーズアレイ解析および網羅的microRNA解析を行った。そのデータを解析し肝芽腫における進展に関する候補遺伝子を選別している。ｍRNA・ヒストン修飾に関しては本年度に施行できなかったが，ヒストン修飾の解析については来年度に施行するための調整を行っている。今後は計画書の通り，絞り込まれた候補遺伝子に対してバイサルファイトパイロシークエンスによるメチル化率測定およびmicroRNA のquantitative real time PCRによる定量測定を30-40例で施行しvalidationを行う計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
対象は4症例の肝切除された肝芽腫症例で行った。同症例の切除検体より正常肝・胎芽型腫瘍部・胎児型腫瘍部を病理医による診断に基づいて部位を決定し、同部位よりDNAおよびRNAを抽出した（12サンプル）。計画書にあるようにメチル化ビーズアレイ解析およびmicroRNAアレイ解析を行った。メチル化ビーズアレイ解析については，異常高メチル化および異常脱メチル化の両面からアプローチし，腫瘍の進展に関わる候補遺伝子を選別した。一部遺伝子に関してはパイロシークエンサーによるメチル化率の測定のためのプローブを設計しているところである。microRNAアレイに関しては，進展に伴い変化するmicroRNAの選別を行い，絞り込みをしている。ｍRNA解析およびCHIP-sequencing解析（ヒストン修飾）については、検体調整に問題があり本年度に施行し得なかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
メチル化ビーズアレイの解析結果とmicroRNAアレイの解析結果を統合的相補的に解析し，進展に関わる遺伝子の絞り込みを行う。当初の予定通り絞り込まれた遺伝子に対して，メチル化率の測定をバイサルファイトパイロシークエンス法により，またmicroRNAの定量をquantitative real time PCR法により，30～40検体程度で遺伝子個別に行う予定である。
今回の検体から抽出したRNAではmicroRNAの解析は可能であったが，mRNAの解析には断片化の理由により施行できなかった。今後の対策としては，発現の解析についてはタンパク質抽出によるWestern blotting法もしくはFFPE切片の免疫組織染色法により行う予定とした。
また，候補遺伝子の絞り込みの進み具合により，症例を適宜追加し，DNAメチル化解析の結果やmicroRNA解析の結果と矛盾する事象に対して候補遺伝子に対するヒストン修飾解析やｍRNA発現解析を個別に行うことで補完することを考えている。
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| Causes of Carryover |
初年度実施を予定していたmRNA解析およびCHIP-sequencing解析（ヒストン修飾）については，検体調整に問題があり(検体の品質等)施行し得なかったため，その分の費用が次年度繰り越しとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額となった予算で，症例の追加を行い①メチル化ビーズアレイ，②パイロシークエンス，③microRNA解析を施行することを計画している。
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