2017 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of transcriptional network system of chondrocytes by novel gene-editing cloning technique
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16K15779
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
西村 理行 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (60294112)
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2016-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 軟骨細胞 / 転写因子 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．平成２８年度に同定した転写因子の発現が、BMP2の刺激を加えることにより、タンパク質レベルで増加するものの、mRNAレベルでは変動しない理由を明らかにするために、当該転写因子のタンパク質の安定性を生化学的に探索した。その結果、BMP2を未分化間葉系細胞株に添加すると、当該転写因子の発現が安定することが示された。その分子メカニズムを検討したところ、BMP2の非存在下では当該転写因子がユビキチン化されていることが見出された。またプロテアソーム阻害剤を用いた実験により、当該転写因子がタンパク質レベルで増加することも確認できた。したがって、未分化間葉細胞では、当該転写因子は、通常、ユビキチン-プロテアソーム経路にてタンパク質分解を受ける一方、BMP2の存在下では、ユビキチン-プロテアソーム経路から逃れ、タンパク質が安定化し、未分化間葉系細胞の軟骨細胞への分化を促進すると考えられた。
２．当該転写因子のユビキチン化機構に関与するユビキチン化酵素を同定するために、未分化間葉系細胞に、Flagタグを付した当該転写因子を導入し、抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行った。この免疫沈降サンプルを質量分析にて解析したところ、ユビキチン化酵素と結合を見出し、免疫共沈降法でもその結合が確認された。興味深いことに、BMP2を未分化間葉系細胞に作用させると、当該転写因子とユビキチン化酵素の結合が解かれることも見出した。これらの結果から、BMP2はこの結合を阻害することにより当該転写因子の安定化を促していると示唆された。
３．当該転写因子のin vivoでの機能を検索するために、Cas9ゲノム編集法を用いて同分子のノックアウトマウスの作製を行った結果、胎生致死またはdwarfを示した。したがって、当該転写因子は個体レベルでも軟骨形成の制御に関与し骨格形成に深く関与している可能性が示された。
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