2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞内損傷乗り越え複製アッセイを用いたアクリルアミド誘発遺伝毒性の分子機構の研究
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16K16199
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
赤木 純一 国立医薬品食品衛生研究所, 病理部, 主任研究官 (60512556)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 損傷乗り越え複製 / グリシドアミド付加体 / アクリルアミド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は食品の加熱調理により生成する発がん性物質であるアクリルアミドの活性代謝産物であるグリシドアミド（GA）付加体の損傷乗り越えDNA合成（TLS）に関わるDNAポリメラーゼを明らかにすることを目的としている。GAは主にグアニンのN7位に付加体（N7-GA-dG）を形成するが、グアニンのN7位のアルキル化体は脱塩基しやすいため、糖部に2′-デオキシ-2′-フルオロアラビノグアノシンを持つdGアナログ（FdG）を用いて付加体合成を行った。具体的には、FdGの前後をGAとの反応性を持たないdTのみとした9塩基のオリゴヌクレオチド（5′-dTTTTFTTTT-3′; F=FdG）にGAを反応させ、反応産物をHPLC精製した後、足場オリゴヌクレオチドを用いて5′および3′にベクターと相補的な配列をライゲーションし、30-merのオリゴDNA（Gca 30-mer）を作成した。同時にコントロールとして用いるGAと反応させていないFdGを持つオリゴDNA（Cont 30-mer）を作成した。これらのオリゴDNAを特定の部位に持つシャトルベクターを作成し、マウス胚性線維芽細胞（MEF）にトランスフェクションして細胞内で複製させ、複製産物を回収して複製効率および変異スペクトラムを解析した。その結果、N7-GA-FdGの複製効率はコントロールと比べて約半分程度に低下しており、GA付加体によりDNA複製が強く阻害されることが示唆された。一方でN7-GA-FdGの複製において塩基置換・欠失変異体の頻度はそれぞれ1%程度であったことから、GA付加体による複製阻害を正確に乗り越える機構が存在すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
N7-GA-FdGを持つオリゴDNA、コントロールとしてFdGを持つオリゴDNA、及び無修飾のdGを持つオリゴをpMTEX-GA1ベクターに組み込み、MEFにトランスフェクションして細胞内で複製させた。複製産物を回収して解析した結果、無修飾のdGでは両側の鎖がほぼ半々の割合で複製されたのに対して、FdG鎖の場合は22%程度に低下した。さらに、N7-GA-FdG鎖の場合はわずか6%であった。このことから、N7-GA-FdGにより複製が強く阻害されることが示唆されたが、一方で付加体のないFdGでも複製効率が約半分に低下していたことから、FdGが複製を阻害してしまうか、あるいはDNA修復機構により除去されてしまう可能性が考えられた。そこでヌクレオチド除去修復機構を欠損したXpc-/-マウス由来MEFを用いて同様の実験を行ったところ、dGとFdGの複製効率はほぼ同等であり、一方でN7-GA-FdGの複製効率はコントロールと比べて約半分程度に低下していた。このことから、GA付加体によりDNA複製が強く阻害されると考えられた。N7-GA-FdG鎖の複製産物の変異頻度をシークエンス解析により調べたところ、塩基置換・欠失変異体の頻度はそれぞれ1%程度であったことから、GA付加体による複製阻害を正確に乗り越える機構が存在することが示唆された。また、FdGはヌクレオチド除去修復の基質として認識され除去されてしまうものの、複製は阻害しないと考えられたためヌクレオチド除去修復欠損細胞を用いることで複製効率の測定が可能であると考えられた。そこで、SV40でトランスフォームしたXPC欠損細胞で複製アッセイを行うために、pMTEX-GA1ベクターのポリオーマオリジンとポリオーマT抗原をSV40オリジンに置換したベクターを作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
FdGは立体構造をほとんど変化させないことが報告されていたものの、本年度の結果からヌクレオチド除去修復の基質として除去されてしまうことが明らかになった。そのため、N7-GA-FdGの複製におけるTLSポリメラーゼの寄与を解析するためにはNER欠損細胞をベースとして、ゲノム編集でTLSポリメラーゼ欠損細胞の作出を行う必要があると考えられた。MEFは不死化の過程で染色体数がほぼ倍加することが知られており、ゲノム編集によるノックアウト効率が悪いことが考えられたため、ヒトのXP細胞をベースとしてゲノム編集を行うこととした。XP-C患者由来細胞株であるXP4PASVはSV40ラージT抗原を発現しているため、pMTEX-GA1のポリオーマウイルスのT抗原と複製起点をSV40複製起点に置き換えてこの細胞内で複製するpMTEX-GA2シャトルベクターを作製した。このベクターの一本鎖DNAを作成し、無修飾のdGを持つ30-merのオリゴヌクレオチドを組み込んでXP4PASV細胞にトランスフェクションした。細胞から回収したプラスミドをDpnIで処理した後に大腸菌を形質転換可能であったことから、このベクターが細胞内で複製されることを確認している。現在、XP4PASV細胞のPOLHおよびPOLK遺伝子のノックアウトを行っており、細胞が作出できればこれらの細胞を用いて細胞内TLSアッセイを実施する予定である。さらに、昨年までの研究で作出したN7-GA-FdGを持つ30-merのオリゴヌクレオチドを鋳型として、32Pで標識した16-merのプライマーをアニールさせて、精製DNAポリメラーゼ（Polκ等）によるin vitroでの乗り越え活性についても解析を行う。
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| Causes of Carryover |
今年度は研究所の移転作業に伴い約2ヶ月間実験が実施できない期間があったため、消耗品費およびシークエンス解析費の支出が予定より少なかった。次年度の研究計画で使用する予定である。
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