2017 Fiscal Year Research-status Report
組換えBrevibacillus属細菌を用いたセルロースからの直接エタノール生産
Project/Area Number |
16K16229
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Research Institution | Miyagi University |
Principal Investigator |
柳澤 満則 宮城大学, 食産業学群(部), 助教 (00647000)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | Brevibacillus / セルラーゼ |
Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、Brevibacillus choshinensisにセルロースを分解する酵素であるセルラーゼの遺伝子を導入し、その発現や酵素の分泌について確認した。なお、既に平成28年度の時点でセルラーゼ遺伝子の発現に成功していたが、使用するプラスミドベクターや宿主となるBrevibacillus choshinensisを変更して研究を進めた。 まず、組換え酵素を発現、分泌させるためのプロモーター、シグナルペプチド、およびターミネーターを得ることを試みた。プラスミドベクターpHY300PLKにGeobacillus stearothermophilus由来のアミラーゼ遺伝子を挿入し、構築したプラスミドをBrevibacillus choshinensis NBRC15518に導入したところ、アミラーゼを発現、分泌させることに成功した。このことから、本遺伝子のプロモーター、シグナルペプチド、およびターミネーターを用いることで、NBRC15518株に外来遺伝子を発現、分泌させることが可能であることが確かめられた。 次に、Saccharophagus degradans由来の4種類のセルラーゼ遺伝子、Clostridium thermocellum由来の8種類のセルラーゼ遺伝子を、上述のプロモーター、シグナルペプチド、およびターミネーターに接続してそれぞれNBRC15518株に導入した。その結果、一部、構築プラスミドが導入できないものやセルラーゼの分泌が確認できないものがあったものの、セルラーゼの発現、分泌が可能になる遺伝子を複数種類スクリーニングすることができた。 ただし、発現、分泌に成功したセルラーゼ遺伝子は、いずれもエンド型のセルラーゼ遺伝子であったため、エキソ型のセルラーゼ遺伝子の発現、分泌について、その活性の測定方法を含めて再検討する必要性が生じた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究計画では、平成28年度、29年度のうちにエタノールを生産可能な組換えBrevibacillusを構築する予定であったが、平成28年度の時点で予想以上に困難であることがわかっていた。そのため、セルロース分解能を有する組換えBrevibacillusの構築を前倒しで進めてきた。しかしながら、エンド型セルラーゼの分泌は確認できたものの、エキソ型セルラーゼの分泌を確認することができなかった。このことから、現時点では、セルロース分解能を有する組換えBrevibacillusを構築できていない状況となっている。 一方、エタノールを生産可能な組換えBrevibacillusを構築することも並行して進めたものの、平成28年度と同様にアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)の遺伝子を発現させることが困難となっている。加えて、プロモーターや遺伝子等を変更するとプラスミドの構築が困難となる(大腸菌に導入できなくなる)場合があり、遺伝子を挿入するプラスミドベクターの位置を予備的に検討せざるを得なくなった。 以上のように、研究計画通りに進めることができなかった部分があったことに加え、予想外の課題が生じてきたことから、進捗状況はやや遅れていると判断した。
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Strategy for Future Research Activity |
まず、エキソ型セルラーゼを分泌可能な組換えBrevibacillusを構築する必要があるため、活性測定に適した基質の検討や、組換えBrevibacillusの菌体内酵素の活性測定をおこなう。 基質の検討では、これまで使用していた結晶性セルロースやAzo-Avicelでは、結晶性が高くエキソ型セルラーゼの活性を測定できるほど分解されないことが予想されたため、リン酸膨潤セルロース、αセルロース、濾紙粉末等の分解性を確認することで、活性測定に適した基質をスクリーニングする。 一方、組換えBrevibacillusの菌体内酵素の活性測定は、遺伝子が発現されているにも関わらず分泌されていないのか、遺伝子そのものが発現されていないのかを明確にすることにつながり、その結果によって、導入する遺伝子の種類、その領域、そこに接続するシグナルペプチドの種類等を検討することで、エキソ型セルラーゼを分泌可能になることが期待される。 また、エタノールを生産可能な組換えBrevibacillusを構築することも進める予定である。このためには、ADH遺伝子の発現を成功させる必要があり、複数種類のADH遺伝子を導入することで、発現可能な遺伝子をスクリーニングすることを計画している。加えて、既に発現に成功しているピルビン酸脱炭酸酵素(PDC)の遺伝子や乳酸脱水素酵素(LDH)の遺伝子について、接続するプロモーターを変更させて発現させることにより、菌体内発現させる時に高発現可能なプロモーターをスクリーニングすることも予定している。
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Causes of Carryover |
研究計画段階では、遺伝子を増幅するPCRのためのサーマルサイクラーの購入を予定していたが、平成28年度と同様に大学内の共通機器が十分に使える状況であったため平成29年度も購入の必要がなかった。また、平成29年度初めにはメタボローム解析やマイクロアレイ解析等を外部委託することも予定していたが、解析を外部委託できる状態まで研究を進められなかったことから、次年度以降に見送った。加えて、試薬や器具などの消耗品についても、計画段階で予定していたほど使用しなかったため、計画していた予算からの差が生じ、これらの理由から次年度使用額が生じた。 次年度使用額の使用計画としては、基本的には、必要となる試薬類、器具類の購入などに充当する予定である。また、研究の進捗状況により、研究計画段階では予定していなかったメタボローム解析やマイクロアレイ解析等を外部委託することに充当し、代謝に関する解析を進めることも考えている。さらに、研究の進捗状況が予定よりも遅れていることから、遺伝子の人工合成やプラスミドの構築等を外部委託することに充当することで研究室での必要作業量を減らし、研究を進めるスピードを上げることも予定している。
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