組換えBrevibacillus属細菌を用いたセルロースからの直接エタノール生産

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K16229
• Research Institution: Miyagi University
• Principal Investigator: 柳澤 満則 宮城大学, 食産業学群(部), 助教 (00647000)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Brevibacillus / セルラーゼ

Outline of Annual Research Achievements

平成30年度は、セルラーゼ遺伝子を導入した組換えBrevibacillusについて、分泌するセルラーゼの活性を確認、比較した。
エンド型セルラーゼとしては、平成29年度に発現、分泌が確認できたCelA、CelD、Cel5H、およびCel9Bの4種類を使用し、それらの遺伝子を導入したBrevibacillus choshinensis NBRC15518のセルラーゼ活性を比較した。それぞれの組換えNBRC15518株の培養液をCMC、およびαセルロースに作用させ、生成する還元糖の濃度を測定したところ、CMCではCel5Hが、αセルロースではCelAが最も高い還元糖濃度を示した。このことから可溶性であるか不溶性であるかによって、分解に最適なエンド型セルラーゼは変わることが示唆された。また、HPLCにより生成した糖を測定したところ、Cel9B以外の3種類の酵素はCMCとαセルロースの両方の基質から2糖を生産することが確かめられた。
エキソ型セルラーゼとしては、平成29年度に構築はできたものの、発現が未確認であったCelK、Cel48y、Cel6Aの3種類の遺伝子をそれぞれ導入した組換えNBRC15518株の活性を確認、比較した。それぞれの培養液をαセルロースに作用させたところ、いずれのエキソ型セルラーゼも還元糖、2糖を生成することが確認できた。測定結果としては、還元糖、2糖のどちらの濃度も、CelKにおいて最も高く、Cel48yで最も低い値となったが、生成した濃度が低かったことから比較が困難な面もあり、最適なエキソ型セルラーゼをスクリーニングするためには、使用する基質や測定方法についての工夫が必要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成30年度には、エタノール生産能を付与したBrevibacillusに、エンド型セルラーゼ、エキソ型セルラーゼの遺伝子を導入することにより、セルロースから直接エタノールを生産可能な組換えBrevibacillusを構築する研究計画であった。しかしながら、エタノール生産能を付与するために必要なアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子の発現が困難となっており、セルラーゼの遺伝子も最適なエンド型とエキソ型の組み合わせを決定することができておらず、当初予定していた組換えBrevibacillusの構築が達成できていない状況である。
以上のことから、進捗状況はやや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

エンド型セルラーゼとエキソ型セルラーゼについて、それぞれ活性の高い種類をスクリーニングする。不溶性で分解しやすい基質としてリン酸膨潤セルロースやビーズミル処理セルロースを使用し、平成30年度と同様の方法によりセルラーゼの活性を測定、比較することにより最適なセルラーゼの種類をスクリーニングする。
その後、スクリーニングした遺伝子を組み合わせてNBRC15518株に導入し、構築した組換えNBRC15518株をセルロースに作用させ、培養しながらセルロースを2糖であるセロビオースに分解することを試みる。ここで、セルロースとしては、試薬の基質の他に実際のバイオマスとしてタケ粉末やホヤ被嚢粉末なども使用する予定である。なお、NBRC15518株がセロビオースを資化できないことを別途確かめているため、培養しながらセルロースを分解してもセロビオースを生産することが可能である。さらに、セロビオース以外の3糖以上のオリゴ糖が生成しているかどうかもTLCにより確認する。もし、3糖以上のオリゴ糖も生成しているようであれば、それらのオリゴ糖をセロビオースに分解する酵素も組み合わせることにより、セロビオースの生産量の向上を試みる。
また、エタノールを生産可能な組換えBrevibacillusの構築が困難となっていることから、引き続き構築を試みることに加え、別のアプローチで市販の酵素を使用せずにセルロースからエタノールを生産するプロセスの確立にも取り組む。具体的には、セロビオースからエタノールを生産する酵母をスクリーニングし、セルロースを分解可能な組換えNBRC15518株との2種培養により、セルロースからのエタノール生産を試みる。

Causes of Carryover

研究計画段階では、遺伝子を増幅するPCRのためのサーマルサイクラーの購入を予定していたが、これまでと同様に大学内の共通機器が十分に使える状況であったため購入の必要がなかった。また、試薬や器具などの消耗品についても、計画段階で予定していたほど使用せず、学会発表のための旅費も必要としなかったことから、計画していた予算からの差が生じ、次年度使用額が生じた。
次年度使用額の使用計画としては、基本的には、必要となる試薬類、器具類の購入などに充当する予定である。また、研究の進捗状況が予定よりも遅れていることから、遺伝子の人工合成やプラスミドの構築等を外部委託することや、実験補助員を雇用することを計画しており、これらに必要となる費用に充当することで、研究を進めるスピードを向上させる予定である。