組換えBrevibacillus属細菌を用いたセルロースからの直接エタノール生産

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K16229
• Research Institution: Miyagi University
• Principal Investigator: 柳澤 満則 宮城大学, 食産業学群(部), 助教 (00647000)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Brevibacillus / セルラーゼ / エタノール

Outline of Annual Research Achievements

組換えBrevibacillusによりセルロースをセロビオースに分解し、他の微生物によりセロビオースをエタノールに変換することを想定し、セロビオースからエタノールを生産可能な微生物のスクリーニングを試みた。組換え大腸菌KO11株に加え、セロビオース資化性酵母9株についてセロビオースからのエタノール生産能を調べたが、いずれも高い収率でエタノールを生産することはできないことがわかった。
そこで、組換えBrevibacillusによりセルロースをグルコースにまで分解することを想定し、Brevibacillus choshinensis NBRC15518のグルコース資化性を調べた。その結果、振盪培養ではグルコースを消費してしまうものの、静置培養にすることでグルコースの消費を抑えられることを確かめた。
これにより、セルロースをグルコースに分解する組換えBrevibacillusとエタノール生産微生物を静置条件で2種培養することでセルロースからのエタノール生産が可能になると期待され、セロビオースをグルコースに分解する酵素であるβグルコシダーゼをBrevibacillusに分泌させることを試みた。Clostridium thermocellum由来のbglA遺伝子をNBRC15518株に導入することで、分泌割合は低いものの、βグルコシダーゼを発現させることに成功した。
一方で、これまでBrevibacillusに発現させることができていなかったアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）の遺伝子の発現にも取り組んだ。ピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）の遺伝子とのオペロンとしてプラスミドを構築し直したところ、弱いながらもADHの活性を確認することができた。PDCの活性も確認できたことから、エタノールの生産に必要な2種類の酵素を同時に発現する組換えBrevibacillusを構築することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画では、セルロースから直接エタノールを生産可能な組換えBrevibacillusを構築することになっていた。
しかしながら、セルロースの分解においては、必要となるエンド型セルラーゼ、エキソ型セルラーゼ、およびβグルコシダーゼの3種類の酵素をBrevibacillusに分泌、もしくは発現させることができたものの、それらを組み合わせてセルロースをグルコースに分解することにまだ着手できていない。
また、エタノールの生産においては、必要となるPDCとADHをBrevibacillusに発現させることができたものの、実際にグルコースからエタノールを生産するかどうかの確認ができていない。
以上のことから、進捗状況はやや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

Brevibacillusに分泌させるエンド型セルラーゼとエキソ型セルラーゼについて、それぞれ活性の高い種類をスクリーニングする。その後、スクリーニングしたものとBrevibacillusに発現させたβグルコシダーゼを組み合わせることで、セルロースをグルコースに分解することを試みる。セルロースの分解は、それぞれの酵素をBrevibacillusに分泌、発現させた菌体外酵素を組み合わせる方法や、分泌、発現する組換えBrevibacillusをセルロース含有培地で静置培養させる方法を試みる。
また、この方法によるセルロースのグルコースへの分解と、エタノール生産微生物の培養を組み合わせることにより、セルロースからのエタノール生産に取り組む。
一方、PDCとADHを発現する組換えBrevibacillusが構築できたため、この組換えBrevibacillusがエタノールを生産するかどうかを確認する。ただし、現段階ではADHの活性が弱いことから、さらに強く発現させるためのプロモーターの種類の検討も進める予定である。加えて、Brevibacillusのメタボローム解析もおこない、グルコースがどのように代謝されているのかを把握することで、組換えBrevibacillusに高収率でエタノールを生産させるために必要となる物質や酵素についても明らかにする。

Causes of Carryover

研究計画段階では、遺伝子を増幅するPCRのためのサーマルサイクラーの購入を予定していたが、共通のものや他の研究室のものが使える状況であったため購入の必要がなかった。また、学会発表のための旅費も必要としなかったことから、計画していた予算からの差が生じ、次年度使用額が生じた。
次年度は、サーマルサイクラーなどの機器類について、共通のものや他の研究室のものが設置場所の変更や使用頻度の増加により使用しにくくなることが予想される。そのため、次年度使用額を必要な備品の購入に充当することを予定している。また、メタボローム解析の外部委託や実験補助員の雇用に必要となる費用にも使用することで、研究を進めるスピードを向上させる予定である。その他にも、これまでと同様に必要となる試薬類、器具類を購入するために使用する。