2020 Fiscal Year Research-status Report
組換えBrevibacillus属細菌を用いたセルロースからの直接エタノール生産
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16K16229
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Research Institution | Miyagi University |
Principal Investigator |
柳澤 満則 宮城大学, 食産業学群, 准教授 (00647000)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | Brevibacillus / セルラーゼ / エタノール |
Outline of Annual Research Achievements |
組換えBrevibacillusによりセルロースをグルコースまで分解することを想定し、Clostridium thermocellum由来のβグルコシダーゼ遺伝子を導入したBrevibacillus choshinensis NBRC15518によるセロビオースからのグルコースの生産を試みた。セロビオースを含む培地で組換えNBRC15518株を静置培養したところ、速度は遅いものの、96時間で約4 g/Lのセロビオースをグルコースに変換することができた。 また、前年度、NBRC15518株にエタノールの生産に必要な2種類の遺伝子を発現させることに成功したものの、エタノールを生産することができなかったことから、NBRC15518株のメタボローム解析を試みた。グルコースを含まない培地とグルコースを含む培地で培養した時の菌体内代謝物質を網羅的に分析したところ、グルコースを含む場合に、解糖系代謝物質の多くが検出された。しかしながら、エタノールの前駆物質であるピルビン酸が検出されず、ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への変換が遅いことがわかった。 ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に変換する酵素がピルビン酸キナーゼであることから、NBRC15518株のピルビン酸キナーゼ活性を調べたところ、他の微生物で報告されている文献値よりも低いことがわかった。このことから、NBRC15518株では、ピルビン酸キナーゼの活性が低いことによりホスホエノールピルビン酸がピルビン酸に変換されず、エタノールを生産するための遺伝子を発現させてもエタノールを生産できないことが示唆された。一方で、同じBrevibacillus属であるBrevibacillus brevis NBRC100599、JCM8970のピルビン酸キナーゼ活性を調べたところ、NBRC15518株よりも高いことを確かめた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の計画では、セルロースから直接エタノールを生産可能な組換えBrevibacillusを構築することになっていた。 しかしながら、セルロースの分解において、エンド型セルラーゼとエキソ型セルラーゼについては、使用する遺伝子の種類を多くしてしまったことから、活性が高いもののスクリーニングに予想以上に時間がかかってしまっている。また、βグルコシダーゼについては、発現させることができても分泌させることが困難であることがわかり、適したものをスクリーニングすることに時間がかかってしまっている。その結果、エンド型セルラーゼ、エキソ型セルラーゼ、およびβグルコシダーゼの3種類の酵素を組み合わせることで、セルロースをグルコースに分解することにまだ着手できていない状態である。 また、エタノールの生産においては、当初予定していなかったBrevibacillus属細菌の代謝解析に高額な費用がかかることからなかなか着手できずにいたため、組換えBrevibacillusによりグルコースからエタノールを生産することに成功していない状態である。 以上のことから、進捗状況は遅れていると判断した。
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Strategy for Future Research Activity |
Brevibacillusに分泌させるエンド型セルラーゼとエキソ型セルラーゼについて、それぞれ活性の高い種類をスクリーニングする。βグルコシダーゼについても活性の高いものを探し、それらを組み合わせることで組換えBrevibacillusによるセルロースからのグルコースの生産を試みる。さらに、酵母や組換え大腸菌KO11株などのエタノール生産微生物と共培養することにより、セルロースからエタノールを生産することに取り組む。 さらに、Brevibacillusにグルコースからエタノールを生産させることも並行して進める。具体的には、ピルビン酸キナーゼ活性が低いNBRC15518株にピルビン酸キナーゼ遺伝子を導入して発現させ、エタノール生産に必要な遺伝子も組み合わせて発現させることを試みる。また、ピルビン酸キナーゼ活性が高いNBRC100599株、JCM8970株への遺伝子導入方法を検討し、エタノール生産に必要な遺伝子を導入して発現させることを試みる。
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Causes of Carryover |
当初、学生を実験補助員として雇用することで実験を進めようとしていたが、新型コロナウイルスの感染拡大により学生の学内への立ち入りが制限され、実験補助員を雇用できなかった分の次年度使用額が生じた。 使用計画については、実験に必要となる基本的な試薬類、器具類、キット類を購入するために使用して研究を推進していく予定である。
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